E imunomodulatorno metabolitura si ključno karakteristika e tumoroske mikroambientoski (TME), numaj nesave eksepciencar, lengere identitetura ačhen but bipindžarde. Kathe, ame analizisardam le tumorura thaj le T-celulen katar le tumorura thaj le ascite le nasvalenqe saven si len baro-grado serozno karcinoma (HGSC) te sikavas o metabolome kadale diferentne TME kompartimenturenqo. O ascite thaj e tumoroske čelalja si len bare diferencie e metabolitencar. Ande relacia e ascitesa, e T-celulen save infiltririnen o tumoro si but barvale ande 1-methylnicotinamide (MNA). Vi te si o nivelo e MNA-qo anθ-e T-celulenqe vazdino, i ekspresia e nikotinamidosqi N-metiltransferazaqi (jekh enzimo savo katalizil o transfero e metil grupenqo kaθar o S-adenozilmetionin anθ-o nikotinamido) si limitirime anθ-e fibroblastură thaj e tumorosqe ćhelură. Funkcionalno, o MNA induciril e T-celulen te ćhiven avri o tumoro-promotirimo citokino tumorosko nekrozako faktoro alfa. Anda kodo, o MNA kerdo katar o TME del kontribucia ki imunitetoski regulacia e T-celulenge thaj reprezentil jekh potencijalno imunoterapijako ciljo vash o tretmano e manushikane kancerosko.
E metabolitura save aven katar o tumoro śaj te avel len jekh baro inhibiciaqo efekto p-i anti-tumoroski imuniteta, thaj maj but thaj maj but evidencia sikavel ke von śaj te aven vi sar jekh śerutno zor vaś o progreso e nasvalimasko (1). Po dur katar o Warburg efekto, e maj palutni buti astarda te karakterizil o metabolikano than e tumoroske čelaljengo thaj lesko phanglipe e imunitetosko than e tumorosko mikroambiento (TME). Studije pe modelura e ćororeske thaj manušikane T-celulenge sikade kaj o metabolizmo e glutaminesko (2), o metabolizmo oxidativno (3) thaj o metabolizmo e glukozako (4) šaj te keren buti independentno pe diferentno subgrupe e imunitetosko. Nesave metabolitura ande kadala droma inhibirinen e anti-tumor funkcia e T-celulenqi. Si sikavdo kaj o phandipe e koenzimosko tetrahidrobiopterin (BH4) shaj te phagel e proliferacia e T-celulenge, thaj o vazdipe e BH4-esko ando trupo shaj te vazdel o anti-tumor imunitetosko responso kerdo katar o CD4 thaj CD8. Paše odova, o imunosupresivno efekto e kynureninesqo śaj te avel arakhlo katar o administracia e BH4 (5). Ano isocitrate dehydrogenase (IDH) mutantno glioblastoma, i sekrecia e enantiometabolikane (R)-2-hydroxyglutarate (R-2-HG) inhibil e T-celulenqi aktivàcia, proliferàcia thaj citolizaqi aktivitèta (6). Akana, sikavdo si kaj o metilglioksal, jekh bi-produkto katar e glikoliza, si kerdo katar e supresorne čelalja katar o mieloidno avindipe, thaj o T-celulosko transfero katar o metilglioksal šaj te inhibiril e efektorno T-celuloski funkcia. Ano tretmano, i neutralizacia e metilglioksalesqi śaj te nakhel i aktivitèta e myeloid-derivirime supresorne ćhelurenqi (MDSC) thaj te vazdel sinergìkanes i terapia e kontrolaqi blokadaqi anθ-e modelură e śuśenqe (7). Kadala studie kolektivo den akcento pe ključno rola e TME-derivirime metaboliturengi ande regulacia e T-celulenqi funkcia thaj aktiviteto.
T-celulenqi disfunkcia si butivar raportirime anθ-o kancèro e ovarienqo (8). Akava si kotor katar e metabolikane karakteristike save si ande hipoksia thaj ande abnormalno tumoroski vaskulatura (9), so kerel te paruvel pes o glukoza thaj o triptofano ande biproduktura sar so si o laktikano acido thaj o kynurenine. O buteder ekstracelularno laktàto redukisarel i produkcia e interferon-γ (IFN-γ) thaj kerel i diferenciàcia e myelosuppressive subgrupenqi (10, 11). O konsumo e triptofanosko direktno inhibiril e T-celulenge proliferacia thaj inhibirinel e T-celulenge receptorengi signalizacia (12-14). Bizo kadala obzervàcie, but buti paśal o imunitèto metabolìzmo sas kerdini anθ-i in vitro T-celulenqi kultùra labǎrindoj optimizirime mèdia, vaj limitirime anθ-e homologikane śuśenqe modelură in vivo, ni jekh anθar save na sikavel pherdo i heterogenitèta e manuśkane kancerurenqi thaj e Fyziologikane makro thaj mikro ambièntosqi.
Jekh ćaćutno xarakteristika e kancerosqe e ovarienqo si o śerdipen e peritoneàlo thaj o sikavipen e ascitesqo. I akumulàcia e ćhelurenqi anθ-o ascites si asociime e nasvalimatenθar maj anglal thaj e bilaćhe prognòzaça (15). Palal e raportură, kadava unikalno kotor si hipoksikano, si les baro nivelo e vaskularno endoteliàlo barvalipnasqo faktoro (VEGF) thaj indoleamine 2,3-dioxigenaza (IDO), thaj si infiltrime katar T-regulatorne ćhelură thaj mieloidne inhibitorne ćhelură (15-18). O metabolikano ambiènto e ascitesqo śaj te avel aver katar kodo e tumorosqo korkoro, kadja o reprogramisaripen e T-celulenqo anθ-o peritoneàlo than si na-klaro. Paše odova, e ključne diferencie thaj heterogeniteto maškar e ascite thaj e metabolitura prezentirime ano tumorosko ambienti šaj te phanden e infiltracia e imunitetosko thaj olengere funkcie pe tumora, thaj trubul maj dur rodipe.
Te śaj te laćharas kadala problemură, ame kerdam jekh metoda vaś e sensitivo separacia e ćhelurenqi thaj e tandem mass spektrometria (LC-MS/MS) te studirinas diferentne ćhelurenqe tipuria (maśkar lende CD4 + thaj CD8 + T ćhelură) sar vi and-o thaj maśkar e tumorură Lesqe metabolitură ćhiven e ćhelură anθ-o sa kodo ascites thaj tumorosqo ambiènto e pacientosqo. Amen hasnisaras kadi metoda ande konjuktura e bare-dimenzionalno fluksoske citometriasa thaj e jekh-celulosko RNA sekvenciripe (scRNA-seq) te das jekh but reslo portreto e metabolikane statusosko kadale ključne populaciengo. Kadi metoda sikavel jekh signifikantno vazdipe ando nivelo e 1-metilnikotinamidosko (MNA) ande tumoroske T-celulen, thaj in vitro eksperimentura sikade ke o imunomodulaciako efekto katar o MNA pe T-celulenqi funkcia sas maj anglal bipinʒardo. Ande generalo, kadi metoda sikavel e mutualno metabolikane interakcie maškar e tumorura thaj e imunitetoske čelalja, thaj del unikalne dikhimata pe imunitetoske regulaciake metabolitura, save šaj te aven lačhe pala o tretmano e T-celulenqo bazirime pe ovarijako kancero imunoterapia Tretmanoske šajimata.
Amen hasnisaras bari-dimenzionalo fluksoski citometria te kvantifikisaras simultàno o glukozako astaripe [2-(N-(7-nitrophenyl-2-oxa-1,3-diaza-4-yl)amino)-2-deoxyglucose (2-NBDG) thaj e mitokondrialno aktivitèta [MitoTracker Deep Red (MT DR)] (MT DR, 2017, 2019) si rigate tipicno markeri save keren diferencija mashkar e imunitetoske čelalja thaj e populacije e tumoroske čelalenge (Tabela S2 thaj Figura S1A). Kadi analìza sikavdăs ke ande relacia e T-celulenqe, e ascites thaj e tumoroske ćhelură si len maj baro nivelo e glukozaqo, numaj si len maj tikne diferencie anθ-i mitokondriàlo aktivitèta. O śerutno glukozaqo śerutno e tumorosqe ćhelurenqo [CD45-EpCAM (EpCAM)+] si trin źi śtar drom maj baro sar e T-ćhelurenqo, thaj o śerutno glukozàqo śerutno e CD4 + T-ćhelurenqo si 1.2 drom maj baro sar e CD8 + T-ćhelurenqo, so sikavel ke e Tumor infiltràciaqe limfocitură (TIL) si len diferentne metabolikane trubujimata vi anθ-i sasti figura TAME (Figura 1). Ko kontrasto, i mitokondriàlo aktivitèta anθ-e tumorosqe ćhelǎ si sar kodola e CD4 + T ćhelurenqe, thaj i mitokondriàlo aktivitèta anθ-e duj ćhelurenqe tipuria si maj bari sar kodola anθ-e CD8 + T ćhelǎ (Figura 1B). Ande generalo, kadala rezultatura sikaven o metabolikano nivelo. I metabolikani aktivitèta e tumorosqe ćhelurenqi si maj bari sar e CD4 + T ćhelurenqi, thaj i metabolikani aktivitèta e CD4 + T ćhelurenqi si maj bari sar e CD8 + T ćhelurenqi. Bizo kadala efektura maškar e tipuria e ćhelurenqe, naj jekh konzistento diferènca anθ-o metabolikano statuso e CD4 + thaj CD8 + T ćhelurenqo vaj anθ-e lenqe relative proporcie anθ-o ascites ande relacia e tumorurenqe (Figura 1C). Ande kontrasta, ande CD45-celulenqi frakcia, i proporcia e EpCAM+ ćhelurenqi anθ-o tumoro barǒl ande komparacia e ascitesqe (Figura 1D). Amen dikhlam vi jekh klaro metabolikani diferènca maśkar e EpCAM+ thaj EpCAM- ćhelurenqe komponente. E EpCAM+ (tumor) ćhelura si len maj baro glukozako astaripe thaj mitokondrialno aktiviteto sar e EpCAM- ćhelura, so si but maj baro katar e metabolikani aktiviteta e fibroblasturengi ande tumoroske ćhelura ande TME (Figura 1, E thaj F).
(A thaj B) Maśkaruni fluorescèncaqi intenzitèta (MFI) e glukozaqi (2-NBDG) (A) thaj mitokondriàlo aktivitèta e CD4 + T ćhelurenqi (MitoTracker kalo lole) (B) Reprezentìvo grafikură (ka-o ćaćutno rig) thaj tabulisarde dàte (ka-o ćaćutno), CD8 + T ćhelură thaj EpCAM + CD45-ćhelură katar e tumorură sar tumorură. (C) O raporto e CD4 + thaj CD8 + ćhelurenqo (e CD3 + T ćhelurenqo) anθ-o ascites thaj anθ-o tumoro. (D) Proporcia e EpCAM + tumoroske ćhelurenqi anθ-o ascites thaj anθ-o tumoro (CD45−). . (G) Reprezentàciaqe grafikură e CD25, CD137 thaj PD1 ekspresiaqe katar i citometria e ćhibăqi. (H thaj I) CD25, CD137 thaj PD1 ekspresia pe CD4 + T čelalja (H) thaj CD8 + T čelalja (I). (J thaj K) Naivno, centralno memorija (Tcm), efektoro (Teff) thaj efektoro memorija (Tem) fenotipura bazirime pe ekspresia e CCR7 thaj CD45RO. Reprezentàciaqe imaźură (ka-o ćaćutno rig) thaj tabularne dàte (ćaćutno) e CD4 + T-celulenqe (J) thaj CD8 + T-celulenqe (K) anθ-e ascites thaj tumorură. P-value determinisarde katar o parno t-test (*P<0.05, **P<0.01 thaj ***P<0.001). I linia reprezentisarel e pacienten save si phangle (n = 6). FMO, fluorescenca minus jekh; MFI, maśkaruni fluorescèncaqi intenzitèta.
Maj dur analiza sikavda aver signifikantno diferencie maškar o but resolvirime T-celulenqo fenotipikano statuso. I aktivirime (Figura 1, G źi ko I) thaj efektorno memorija (Figura 1, J thaj K) anθ-e tumorură si but maj frekvento sar o ascites (proporcia e CD3 + T ćhelurenqi). Sar vi, analizindoj o fenotip katar i ekspresia e aktivàciaqe markerurenqi (CD25 thaj CD137) thaj e depleciaqe markerurenqi [programime proteina e meripnaski e ćhelurenqi 1 (PD1)] sikavdăs ke vi te si e metabolikane xarakteristike kadale populacienqe diferentne (Figura S1, B źi k-o E) , Numaj na sas dikhline signifikantne metabolikane diferencie konzistentno maśkar e naivne efektură katar e memoria, vaj subseto (Figura S1, S1 ME). Kadala rezultatura sas konfirmime kana hasnisarde e metode e mašineske sikljovipnaske te den pes automatikane e fenotipura e ćhelurenqe (21), so maj dur sikavdăs i prezènca e bare gin e ćhelurenqi (CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO +) anθ-o ascites e nasvale manuśesqo (Figura S2A ). Mashkar sa e identifikuime tipuria e ćhelurenqe, kadaja populacia e mieloidne ćhelurenqi sikavdăs o maj baro glukozàqo śerutno thaj mitokondriàlo aktivitèta (Figura S2, B źi k-o G). Kadala rezultatura sikaven e zurale metabolikane diferencie maškar e bute tipuria e ćhelurenqe arakhline anθ-e ascite thaj anθ-e tumorură anθ-e HGSC nasvale.
O maj baro pharipe te haćarel pes e metabolomikane karakteristike e TIL-esqe si i trubujipe te izolisarel pes e T-celulenqe mostre save si len dosta śukaripen, kvaliteto thaj kotor katar e tumorură. E maj palune studie sikade kaj e metode vash o sortiribe thaj o barvalipe e perlengo bazirime pe citometria e fluksoski shaj te anen paruvimata ko profilia e metabolitengo e celularno (22-24). Te śaj te nakhavas kadava problèmo, ame optimizisaras i metoda e barvalipnasqi e perlenqi te izolisaras thaj te izolisaras o TIL katar o manuśikano kancèro e ovarienqo sas kerdo kirurgikane anglal i analìza katar o LC-MS/MS (dikh e Materialură thaj e Metode; Figura 2A). Te śaj te dikhel pes o sasto impakto kadale protokolosqo p-e paruvimata e metabolitosqe, ame kerdam komparacia e metabolitosqe profilurenqi e T-celulenqi aktivisarde katar saste donatorură palal o paso e separaciaqo e perlenqo opral e ćhelurenqe save na sas perlenqe separaciaqe numaj ačhile pe glazura. Kadi analìza e kontrolosqi e kvalitetosqi arakhlăs ke si jekh bari korelàcia maśkar kadala duj kondicie (r = 0.77), thaj i tèknikani repetibilitèta e grupaqi 86 metabolìturenqi si la bari repetibilitèta (Figura 2B). Anda kodo, kadala metode śaj te keren jekh ćaćutni analìza e metabolitosqi anθ-e ćhelură save nakhen o barvalimos e ćhelurenqo, kadja te del pes i angluni platforma la bari rezoluciaqi vaś te identifikisarel pes e specifikane metabolitură anθ-o HGSC, kadja te del pes śajsaripen e manuśenqe te len jekh maj baro xatjaripen pal-i ćhelurenqi specifikacia Seksualo metabolizmosqo programo.
(A) Shematikano diagramo e magnetikane perlengo barvalipe. Anglal i analìza katar o LC-MS/MS, e ćhelǎ ka nakhen trin ćàsurǎ palal jekh aver magnetikane barvalipnasqe vaj ka ačhon pe glazura. (B) O efekto e barvalipasko pe butipe e metabolitengo. O prodùso trin mesuraqo vaś svako barvalipnasqo tip ± SE. I lole linie reprezentisarel jekh 1:1 relacia. I intra-klasaqi korelàcia (ICC) e repeticiaqe meśipnasqi sikavdi anθ-i etiketa e axesqi. NAD, nicotinamide adenine dinucleotide. (C) Shematikano diagramo e butjako e analizako e metabolitengo e nasvalengo. Ascite vaj tumora si kidine katar e nasvale thaj krioprezervirime. Jekh tikno kotor katar sako proba sas analizime katar e flow citometria, kana e aver mostre nakhle trin runde barvalipaske vash CD4+, CD8+ thaj CD45- celi. Kadala frakcie e ćhelurenqe sas analizime anθ-o LC-MS/MS. (D) Mapa e toplinaki e standardizirime metabolitoski buti. O dendrogramo reprezentisarel o Ward-esqo grupipen e euklidesqe distancenqo maśkar e mostre. (E) Analìza e śerutne komponentengi (PCA) e mapa e metabolitosqi e mostreski, sikavindoj trin replikàcie vaś svako mostro, e mostre katar o sasto nasvalo si phangle jekhe linieça. (F) O PCA e metabolitosqo profilo e mostresqo kondicionisardo p-o nasvalo (vaś egzàmplo, labǎrindoj parśiàlo redundanca); o tipo e mostresqo si limitirime katar o konvèkso trupo. PC1, maj baro kotor 1; PC2, maj baro kotor 2.
Palal, amen aplikisardam kadaja barvalipnasqi metoda te analizisaras 99 metabolitură anθ-e CD4 +, CD8 + thaj CD45-celulenqe frakcie anθ-e primarno ascite thaj tumorură anθ-e śov HGSC nasvale (Figura 2C, Figura S3A thaj Tabela S3 thaj S4). I populacia savi si interesime si 2% źi ka 70% katar o angluno baro egzàmplo e źivde ćhelurenqo, thaj i proporcia e ćhelurenqi si but diferentno maśkar e nasvale. Palal o ulavipen e perlenqo, i barvali frakcia e interesosqi (CD4+, CD8+ vaj CD45-) si maj but desar 85% sa e źivde ćhelurenqe anθ-o egzàmplo anθ-o prodùso. Akaja metoda e barvalipaski del amen shaipe te analizirina e populacie e ćhelurenqe katar o metabolizmo e manuśikane tumorosqe ćhelurenqo, so si naśti te kerel pes katar bare mostre. Sar hasnisaras kadava protokolo, ame arakhlam ke o l-kynurenine thaj o adenozin, kadala duj laćhe karakterizirime imunosupresivne metabolitura sas vazdine ande tumor T-celulen vaj tumor-celulen (Figura S3, B thaj C). Anda kodo, kadala rezultatura sikaven i ververutnipen thaj i śajmata amare ćhelurenqi separaciaqi thaj e spektrometria e masenqi te arakhel biologikane importantne metabolitură anθ-e paśièntosqe ćàsurǎ.
Amari analìza vi sikavel jekh zurali metabolikani separacia e ćhelurenqi andar thaj maśkar e nasvale (Figura 2D thaj Figura S4A). Ande partikularno, ande relacia e avere nasvalencar, o nasvalo 70 sikavda diferentne metabolikane karakteristike (Figura 2E thaj Figura S4B), so sikavel kaj shaj te avel bari metabolikani heterogeniteta mashkar e nasvale. Si te ovel ramosardo kaj komparacia e javere nasvalencar (1.2 dži ko 2 litre; Tabela S1), o sasto kotor e ascitesqo savo sas kidino ko nasvalo 70 (80 ml) sas maj tikno. O kontrolo e inter-pacientengo heterogenitetosqo anθ-i analìza e śerutne komponentenqi (sar egzàmplo, labǎrindoj analìza e parśiàlo redundancaqi) sikavel konzistènto paruvimata maśkar e ćhelurenqe tipuria, thaj e ćhelurenqe tipuria thaj/vaj o mikroambiènto si klaro agregisarde palal o profilo e metabolitosqo (Figura 2F ). I analìza e jekhe metabolìturenqi akcentisardas kadala efektură thaj sikavdăs signifikantne diferencie maśkar e ćhelurenqe tipuria thaj o mikroambiènto. Si te ovel ramosardo kaj i maj bari diferènca savi dikhel pes si MNA, savi si butivar barvali anθ-e CD45- ćhelură thaj anθ-e CD4+ thaj CD8+ ćhelură save infiltrisaren o tumoro (Figura 3A). Palal e CD4 + ćhelura, kadava efekto si maj obviousno, thaj o MNA ande CD8 + ćhelura vi dikhel pes te avel zurales afektirime katar o ambiènto. Numaj, akava nane importantno, soske numa trin kotar e šov nasvale šaj te oven evaluime vash o tumor CD8+ skorura. Po dur katar o MNA, ande diferentne tipuria e čelalenge ande ascite thaj tumorura, aver metabolitura save si bilačhe karakterizirime ande TIL si vi diferentno barvale (Figura S3 thaj S4). Anda kodo, kadala date sikaven jekh laćho set imunomodulatorikane metaboliturengo vaś maj dur rodipen.
(A) Normalizirimo sasto MNA ano CD4+, CD8+ thaj CD45- čelalja kotar o ascite thaj o tumoro. O grafiko e kutijako sikavel i mediana (linia), o interkvartilno rango (frame hinge) thaj o data range, dži ko 1.5 drom o interkvartilno rango (frame whisker). Sar si deskriptirime ano Pacientesko Materialo thaj Metode, utilizin e pacientesko limma valuto te arakhen o P valuto (*P<0.05 thaj **P<0.01). (B) Shematikano diagramo e MNA metabolizmosko (60). Metabolitura: S-adenosyl-1-metionine; SAH, S-adenozin-1-homocistein; NA, nicotinamide; MNA, 1-methylnicotinamide; 2-PY, 1-metil- 2-piridona-5-karboksamida; 4-PY, 1-metil-4-piridona-5-karboksamida; NR, nikotinamid riboza; NMN, nikotinamid mononukleotid. Enzime (zeleno): NNMT, nikotinamida N-metiltransferaza; SIRT, sirtuins; NAMPT, nicotinamide phosphoribosyl transferase; AOX1, aldehid oxidase 1; NRK, nicotinamide riboside kinase; NMNAT, nicotinamide mono Nucleotide adenylate transferase; Pnp1, purin nukleozid fosforilaza. (C) t-SNE e scRNA-seq e ascitesqo (śukar) thaj e tumorosqo (lole; n = 3 nasvale). (D) NNMT ekspresia ande diferentne populacie e ćhelurenqe identifikuime anθ-o scRNA-seq. (E) Ekspresia e NNMT thaj AOX1 ano SK-OV-3, manušikane embrionalno buke (HEK) 293T, T čelalja thaj MNA-tretirime T čelalja. I pherdo ekspresia si sikavdi ande relacia e SK-OV-3. O ekspresiako modelo e SEM-esa si sikavdo (n = 6 saste donatora). E Ct-esqe valutură maj bare sar 35 si konsiderime sar na-detektibilno (UD). (F) Eksprèsia e SLC22A1 thaj SLC22A2 anθ-e SK-OV-3, HEK293T, T ćhelură thaj T ćhelură tretirime 8mM MNA. I pherdo ekspresia si sikavdi ande relacia e SK-OV-3. O ekspresiako modelo e SEM-esa si sikavdo (n = 6 saste donatora). E Ct-esqe valutură maj bare sar 35 si konsiderime sar na-detektibilno (UD). (G) Sasto MNA e ćhelurenqo anθ-e aktivime saste donorǎqe T ćhelǎ palal 72 òre inkubacia e MNA-ça. O ekspresiako modelo e SEM-esa si sikavdo (n = 4 saste donatora).
MNA si kerdo kana transferisarel pes i metil grupa katar S-adenosyl-1-metionine (SAM) ko nikotinamido (NA) katar o nikotinamido N-metiltransferaza (NNMT; Figura 3B). NNMT si but ekspresime ande but manušikane kancerura thaj si asociirime e proliferaciasa, invaziasa thaj metastazasa (25-27). Te śaj te xatǎras maj miśto o źanglipe e MNA-qo anθ-e T-celulenqe anθ-o TME, amen hasnisaras o scRNA-seq te karakterizisaras i ekspresia e NNMT-esqi anθ-e ćhelurenqe tipuria anθ-e ascites thaj tumorură anθ-e trin HGSC paśiènturǎ (Tabela S5). I analìza e aproksimativno 6,500 ćhelurenqi sikavdăs ke anθ-e ascites thaj anθ-e tumorosqe ambièntură, i NNMT-esqi ekspresia sas limitirime anθ-e populacie e fibroblastosqe thaj e tumorosqe ćhelurenqe (Figura 3, C thaj D). Si te ovel ramosardo kaj nane obviousno NNMT ekspresia ki nisave populacia savi sikavel PTPRC (CD45 +) (Figura 3D thaj Figura S5A), so sikavel kaj o MNA detektirimo ko metabolitesko spektro si introducirimo ko T celi. I ekspresia e aldehidosqi oxidaza 1 (AOX1) paruvel o MNA anθ-o 1-metil-2-piridono-5-karboksamido (2-PYR) vaj 1-metil-4-piridono-5-karboksamido (4- PYR); I figura 3B) si vi limitirime ki populacia e fibroblasturenqi savi sikavel COL1A1 (Figura S5A), savi khetane sikavel kaj e T-celulenqe na si len i śajpe te keren konvencionalo MNA metabolizmo. O ekspresiako modelo kadale MNA-relaciake genenqo sas verifikuime labǎrindoj jekh dujto independento set e ćhelurenqo katar e ascite katar e HGSC nasvale (Figura S5B; n = 6) (16). Paše odova, analiza e kvantitativno polimerazake lancoske reakciaki (qPCR) e saste donatorenge T-celulenge save sas tretirime e MNA-sa sikavda kaj ande relacia e kontrolasa SK-OV-3 ovarikane tumoroske celienca, NNMT vaj AOX1 sas paše na ekspirime (Figura 3E). Kadala na-aźukerde rezultatura sikaven kaj o MNA śaj te avel ćhivdo katar e fibroblastura vaj tumora ande paśutne T-celulen ande TME.
Vi te si e kandidatura ande familija e organikane kationenge transportorengi 1 dži ko 3 (OCT1, OCT2 thaj OCT3) kodime katar e familija e solubilno transportorengi 22 (SLC22) (SLC22A1, SLC22A2 thaj SLC22A3), e potencijalne transportora e MNA-ske si inke bidefinime (28) . QPCR e mRNA-esko katar saste donatorenge T-celi sikavelas tikne ekspresiake nivelura katar SLC22A1 numaj na-detektibilno nivelura katar SLC22A2, so konfirmisardas ke sas maj anglal raportirime ande literatura (Figura 3F) (29). Ande kontrasta, e SK-OV-3 ovarialno tumoroski linia sikavel baro nivelo e duje transportorengo (Figura 3F).
Te śaj te testisarel pes i śajmata e T-celulenqe te avel len i śajpe te absorbisaren avrutno MNA, e saste donatorenge T-celulenqe sas kultivirime 72 òre anθ-i prezènca e diferentne koncentràcienqi MNA. Ano bi-aźutipe e exogeno MNA-qo, o sasto MNA e ćhelurenqo naśti te avel detektime (Figura 3G). Numaj, e aktivirime T-celulen save sas tretirime e exogeno MNA-sa sikade jekh doza-dependantno vazdipe ande MNA-esko sasto ande e celi, dži ko 6 mM MNA (Figura 3G). Kado rezultato sikavel kaj vi te si o tikno nivelo e transporteresko ekspresiako thaj o bi-aśtipe e maj bare enzimosqo responsibilo vaś o intracelularno MNA metabolizmo, o TIL śaj te lel o MNA.
O spektro e metaboliturengo ande e nasvalengo T-celi thaj in vitro MNA absorpciake eksperimentura vazden e śajmata kaj e fibroblastura asociime e kancerosa (CAF) te ćhiven avri MNA thaj e tumoroske ćhelura śaj te regulisaren o fenotip thaj e funkcia e TIL-esqi. Te śaj te dikhel pes o efekto e MNA-qo pe T-celulenqe, e saste donatorenge T-celulenqe sas aktivime in vitro anθ-i prezènca vaj anθ-i absènca e MNA-qi, thaj sas evaluime lenqi proliferàcia thaj i produkcia e citokinenqi. Palal 7 divesa kana thode pes o MNA ki maj bari doza, o gin e populaciako dujvar maj but sas tikno, kana o vigor sas inkerdo pe sa e doze (Figura 4A). Paše odova, o tretmano e egzogeno MNA-qo resljarda jekh vazdipen e proporciaqo e CD4 + thaj CD8 + T-celulenqo save sikaven o faktoro e tumorosqo nekrozaqo-α (TNFα; Figura 4B). Ande kontrasta, i intracelularno produkcia e IFN-γ sas signifikantno redukime ande CD4 + T celi, numaj na ande CD8 + T celi, thaj na sas signifikantno paruvipe ande interleukin 2 (IL-2; Figura 4, C thaj D). Anda kodo, o enzimo-phanglo imunosorbentno analiza (ELISA) e supernatanturenqo katar kadala MNA-tretirime T-celulenqe kulture sikavdăs jekh signifikantno vazdipen anθ-o TNFα, jekh tiknǎripen anθ-o IFN-γ, thaj na-i paruvipen anθ-o IL-2 (Figura 4, E źi k-o G). . O tiknjaripe e IFN-γ-esko sikavel kaj o MNA shaj te khelel rola ano inhibicia e anti-tumor aktivitetosko e T-celulenqo. Te śaj te simulisarel pes o efekto e MNA-sqo p-i citotoksicitàta kerdini katar e T-celulenqe, e ćhibăqe antigenosqo receptoro T (FRα-CAR-T) ćhibăqe save si len o folato receptoro α thaj CAR-T (GFP) regulime katar e zeleno fluorescento proteina (GFP) -CAR-T) ćhibăqe si kerde katar saste donoră periferikane ratne mononuklearne ćhibăqe (PBMC). E CAR-T ćhelura sas kultivirime 24 ćàsura anθ-i prezènca e MNA-qi, thaj palal kodoja sas ko-kultivirime e manuśkane SK-OV-3 ćhelurenqe tumorosqe ovarìenqe save sikaven o folato receptoro α anθ-o jekh raporto efektoro thaj o ciljo 10:1. O MNA tretmano kerdas jekh signifikantno tiknjaripe ande mudarimaski aktiviteta e FRα-CAR-T čelalenge, savi sas sar e FRα-CAR-T čelalja save sas tretirime e adenozinasa (Figura 4H).
(A) Totalno gin e źivdipnaske ćhelurenqo thaj o dubleripe e populaciaqo (PD) direkto katar i kultura ko dives 7. O bar grafiko sikavel o maśkar + SEM katar śov saste donatorură. Reprezentisarel e dàte katar maj cïra n = 3 bi-phangle eksperimentură. (B ji ko D) CD3/CD28 thaj IL-2 sas hasnime te aktivirinen e T-celulen ko olengere MNA koncentracie 7 divesa. Anglal i analìza, e ćhelǎ sas stimulime e PMA/ionomycin-eça e GolgiStop-eça 4 òre. TNFα (B) ekspresia ande T-celi. Sar misal (ka-o ćaćutno) thaj e tabularno dàte (ka-o ćaćutno) e TNFα-esqe ekspresiaqo anθ-e źivde ćhelură. IFN-γ (C) thaj IL-2 (D) ekspresia ande T-celi. I ekspresia e citokinenqi sas mesurime katar i citometria e ćhibăqi. O bar grafiko sikavel o maśkar (n = 6 saste donatorură) + SEM. Keren jekh-rig analiza e varìancaqi thaj repeticiaqe mesura (*P<0.05 thaj **P<0.01) te dikhen o P-esqo gin. Reprezentisarel e dàte katar maj cïra n = 3 bi-phangle eksperimentură. (E ji ko G) CD3/CD28 thaj IL-2 sas hasnime te aktivirinen e T-celulen ko olengere MNA koncentracie 7 divesa. O mediumo sas kidino anglal thaj palal 4 chasura PMA/ionomycin stimulacia. E koncentracie e TNFα (E), IFN-γ (F) thaj IL-2 (G) sas mesurime ELISA-sa. O bar grafiko sikavel o maśkar (n = 5 saste donatorură) + SEM. O P-esqo gin si determinisardo anθ-i jekh-rigărdi analìza e varìancaqi thaj e repeticiaqe meśimata (*P<0.05). I punktirime linia sikavel o limito e detekciaqo e detekciaqo. (H) Testo e lizaqo e ćhelurenqo. FRα-CAR-T vaj GFP-CAR-T ćhelura sas ćhinavde e adenozinasa (250μM) vaj MNA (10 mM) 24 òre, vaj sas mukhle bi tretirime (Ctrl). O procento e mudaripnasko e SK-OV-3 čelaljengo sas merimo. P-esko vastnipe determinisardo katar o Welch t-testo (*P<0.5 thaj **P<0.01).
Te śaj te ovel jekh mekanìstikano xatjaripen pal-i MNA-dependènto TNFα ekspresiaqi regulàcia, e paruvimata anθ-o TNFα mRNA e MNA-tretirime T-celulenqe sas evaluime (Figura 5A). Saste donatorenge T-celulen save sas tretirime MNA-sa sikade jekh dujvar maj baro nivelo e TNFα transkripciake, so sikavel kaj o MNA si phanglo e TNFα transkripciake regulaciasa. Te śaj te kerel pes i investigàcia kadale śajde regulaciaqe mekanìzmosqi, duj prinʒarde transkripciaqe faktòrură save regulisaren o TNFα, kodo si o aktivime T-celulenqo nuklearno faktòro (NFAT) thaj o specifiko proteino 1 (Sp1), sas evaluime sar respònso k-o MNA phanglipe k-o proksimalno TNFα promotòro ( 30). O TNFα promotoro si les 6 identifikuime NFAT phanglimaske thana thaj 2 Sp1 phanglimaske thana, save si pe jekh than [-55 bazake parura (bp) katar o 5'cap] (30). I kromatinoski imunoprecipitacia (ChIP) sikavel kaj kana sas tretirime e MNA-sa, o phanglipe e Sp1-esko e TNFα promotorosa vazdel pes trin drom. I inkorporàcia e NFAT-esqi vi voj barǒl thaj reslăs i importànca (Figura 5B). Kadala date sikaven kaj o MNA regulirinel e ekspresia e TNFα prekal e Sp1 transkripcia, thaj ko maj tikno nivelo e ekspresia e NFAT.
(A) Komparacia e T-celulenqe kultivirime bi MNA, o paruvipen e TNFα ekspresiaqo anθ-e T-celulenqe tretirime MNA-ça. O ekspresiako modelo e SEM-esa si sikavdo (n = 5 saste donatora). Reprezentisarel e dàte katar maj cïra n = 3 bi-phangle eksperimentură. (B) O TNFα promotoro e T-celulenqo tretirime vaj bi 8 mM MNA-ça palal o NFAT thaj o Sp1 sas kombinime e (Ctrl) thaj PMA/ionomycin stimulaciaça 4 òre. Imunoglobulin G (IgG) thaj H3 sas hasnime sar negativno thaj pozitivno kontrola vash imunoprecipitacia, respektivno. I kvantifikàcia e ChIP-esqi sikavdăs ke o phanglipe e Sp1 thaj NFAT-esqo k-o TNFα promotoro anθ-e MNA-tretirime ćhelură vazdăs pes butvar ande relacia e kontrolaça. Reprezentisarel e dàte katar maj cïra n = 3 bi-phangle eksperimentură. P-esko vaxt determinisardo katar but t-testura (*** P <0.01). (C) Komparaciasa e ascitesa e HGSC-esqe, e T-celulenqe (na-citotoksikane) sikaven maj bari ekspresia e TNF-esqi anθ-o tumoro. E kolora reprezentin diferentno nasvalen. E sikavde ćhelura sas alosarde randomizirime ko 300 thaj ćhivde te limitirinen o buteder ćhivipen (** Padj = 0.0076). (D) Propozime modelo e MNA-qo vaś o kancèro e ovàrienqo. MNA si kerdo ande tumoroske čelalja thaj fibroblastura ande TME thaj si lino katar e T čelalja. O MNA vazdel o phanglipe e Sp1-esko e TNFα promotorosa, so kerel te vazdel pes i TNFα transkripcia thaj e TNFα citokinoski produkcia. MNA kerel vi jekh tiknjaripe ko IFN-γ. Inhibicia e T-celulenqi funkcia kerel te tiknjarel pes i zor te mudarel pes thaj te barjol o tumoro maj sigo.
Palal e raportură, o TNFα si les anglal thaj palal-dependènto anti-tumor thaj anti-tumor efektură, numaj si les jekh pinʒardi ròla anθ-o promoviripen e barvalipnasqo thaj e metastazenqo e kancerosqo e ovarienqo (31-33). Palal e raportură, i koncentràcia e TNFα anθ-e ascite thaj anθ-e tumorosqe tkivo anθ-e paśiènturǎ saven si len kancèro e ovàrienqo si maj bari sar anθ-e tåki benigno (34-36). Sar si o mehanizmo, o TNFα śaj te regulil i aktivàcia, i buti thaj i proliferàcia e parne ratne ćhelurenqi, thaj te paruvel o fenotip e kancerosqe ćhelurenqo (37, 38). Konzistentno kadale arakhadimasa, e diferencijalno genengi ekspresiaki analiza sikavel kaj o TNF sas signifikantno upre-regulirimo ande T-celi ande tumoroske tkiva ande komparacia e ascitesa (Figura 5C). O vazdipe e TNF ekspresiako sas numaj evidentno ande T-celulenqe populacie saven sas jekh na-citotoksikano fenotip (Figura S5A). Ande summa, kadala date suportin o dikhipen kaj o MNA si les duj imunosupresivne thaj tumoroske promovirime efektura ando HGSC.
O fluorescentno etiketiribe bazirime pe citometria e fluksoski kerdas pes i maj bari metoda te studirinel pes o TIL metabolizmo. Kadala studie sikade kaj ande relacia e periferikane ratne limfocitonca vaj T-celulenca katar e sekundarne limfoidne organura, e murine thaj e manušikane TIL si len maj bari tendenca te len glukoza (4, 39) thaj o gradualno xasaripe e mitokondrialno funkciako (19, 40). Vi te dikhlam similarno rezultatura ande kadi studia, o ključno barjaripe si te kerel pes komparacia maškar o metabolizmo e tumoroske čelaljengo thaj TIL katar o sasto resektirime tumorosko tkivo. Konzistentno nesave katar kadala anglune raportura, e tumoroske (CD45-EpCAM +) čelalja katar e ascites thaj e tumorura si len maj baro glukozako astaripe katar e CD8 + thaj CD4 + T čelalja, so sikavel kaj o baro glukozako phabaripe katar e tumoroske čelalja šaj te avel komparativno e ​​T čelalenge. O koncèpto vaś e T-celulenqi kompeticia. TME. Numaj, i mitokondriàlo aktivitèta e tumorosqe ćhelurenqi si maj bari sar e CD8 + T ćhelurenqi, numaj i mitokondriàlo aktivitèta si sa kadja sar e CD4 + T ćhelurenqi. Kadala rezultatura zuraren o arakhipnasqo lav kaj o oxidativno metabolizmo si importanto vaś e tumoroske ćhelura (41, 42). Von vi sugerin kaj e CD8 + T čelalja šaj te oven maj sensitivno vash oxidativno disfunkcia kotar e CD4 + T čelalja, ja kaj e CD4 + T čelalja šaj te utilizin karbonoske źanglimata aver katar e glukoza te arakhen e mitokondrialno aktiviteta (43, 44). Trubul te ovel ramosardo kaj amen na dikhlam diferencija ko glukozako astaripe ja mitokondrialno aktiviteto maškar CD4 + T efektora, T efektor memorija thaj T centralno memorijake čelalja ko ascites. Sar vi, o diferenciàciaqo stàto e CD8 + T-celulenqo anθ-e tumorură na si les khanć te kerel e paruvipnaça anθ-o glukozaqo śerutno, so sikavel i signifikantno diferènca maśkar e T-celulenqe kultivirime in vitro thaj o manuśikano TIL in vivo (22). Kadala obzervàcie sas vi konfirmime katar o labăripen e bi-biasno automatikane alosaripnasqo e populaciaqo e ćhelurenqo, savo maj dur sikavdăs ke e CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO + ćhelură saven si maj baro glukozaqo astaripen thaj mitokondriàlo aktivitèta sar e tumorosqe ćhelură si prevalentne numaj si len Metabolikano aktivo ćhelurenqo populacia. Kadi populacia śaj te reprezentisarel i putativno subpopulacia e myeloidno supresorne ćhelurenqi vaj e plazmacitoidne dendritikane ćhelurenqi identifikuime anθ-i scRNA-seq analìza. Vi te si kadala duj raportirime ande manušikane ovarienge tumorura [45], von inke trubun maj dur buti te deskriptirinel pes kadi mieloidno subpopulacia.
Vi te e metode bazirime pe citometria e ćhibăqi śaj te klarin e generalo diferencie anθ-o glukoza thaj anθ-o oxidativo metabolìzmo maśkar e ćhelurenqe tipuria, e precizno metabolìtură save si kerde kaθar o glukoza vaj aver źanglimata vaś o mitokondriàlo metabolizmo anθ-o TME na sas inke determinisarde. Te del pes i prezenca vaj o bi-aźutipe e metaboliturenqo anθ-e jekh dino TIL subgrupo trubul te kerel pes i purifikàcia e populaciaqi e ćhelurenqi katar o ćororo ćororo. Anda kodo, amari metoda vaś o barjaripe e ćhelurenqo kombinime e spektrometriasa e masesqi śaj te del dikhipen pal-e metabolìtură save si diferentno barvale anθ-e T-celulenqe thaj anθ-e populacie e tumoroske ćhelurenqe anθ-e śajutne pacienturenqe mostre. Vi te si kadaja metoda avantaʒură opral o ćhivipen e ćhelurenqo aktivime katar i fluorescènca, varesave biblioteke e metabolìturenqe śaj te aven afektime pal-i inherènto stabilitàta thaj/vaj pal-i śukar ćàsura (22). Numaj, amari metoda sas śajdi te identifikisarel duj pinʒarde imunosupresivne metabolitură, adenozin thaj kynurenine, sosqe von si but diferentne maśkar e tipuria e mostrenqe.
Amari metabonomikani analìza e tumorenqi thaj e TIL-esqe subtipurenqi del maj but dikhimata pal-i ròla e metabolìturenqi anθ-o TME e ovarìenqo. Anglal, labǎrindoj i citometria e ćhibăqi, arakhlam ke na sas diferènca anθ-i mitokondriàlo aktivitèta maśkar e tumorură thaj e CD4 + T ćhelură. Numaj, LC-MS/MS analìza sikavdăs signifikantne paruvimata anθ-o butipen e metabolìturenqo maśkar kadala populacie, so sikavel ke e konkluzie pal-o TIL metabolìzmo thaj lesqi sasti metabolìkani aktivitèta trubun jekh laćhi interpretàcia. Dujto, MNA si o metabolito savo si les maj bari diferènca maśkar e CD45-celulenqe thaj e T-celulenqe anθ-o ascites, na anθ-e tumorură. Anda kodo, i kompartimentalizacia thaj o than e tumorosqo śaj te avel len diferentne efektură p-o TIL metabolizmo, so sikavel i śajdi heterogenitèta anθ-jekh dino mikroambiènto. Trinto, i ekspresia e MNA-kerutne enzimosqi NNMT si maj but limitirime ko CAF, savo si tumoroske ćhelura ko maj tikno nivelo, numaj detektibilno MNA nivelura si dikhline ko T ćhelura save aven katar o tumoro. I buteder ekspresia e NNMT-esqi anθ-o CAF e ovarìenqo si la jekh pinʒardo efekto savo vazdel o kancèro, jekh kotor palal o promoviripe e CAF-esqo metabolizmosqo, e tumorosqi invazia thaj e metastaze (27). Vi te si o sasto nivelo e TIL-esqo maśkar, i ekspresia e NNMT-esqi anθ-o CAF si paśe phanglo e Cancer Genome Atlas (TCGA) mezenhimalno subtiposa, savo si asociime e bilaćhe prognòzaça (27, 46, 47). Po agor, i ekspresia e enzimosqi AOX1 responsibilo vaś i degradàcia e MNA-qi si vi limitirime k-i populacia CAF, so sikavel ke e T-celulenqe na si len i śajpe te metabolizirin o MNA. Kadala rezultatura den suporto e idejake kaj vi te trubul maj dur buti te verifikuil pes akava arakhipe, o baro nivelo e MNA-esko ande T-celulen shaj te sikavel e prezenca e imunosupresivno CAF mikroambientoski.
Gindoj pe o tikno nivelo e ekspresiako e MNA transportorengo thaj o na-detektibilno nivelo e ključne proteinengo save si ande MNA metabolizmo, i prezenca e MNA ande T-celulen si bi-aźukerdi. Ni NNMT ni AOX1 nashti te arakhen pes katar scRNA-seq analiza thaj qPCR targetirime katar duj independentno kohortura. Kadala rezultatura sikaven kaj o MNA na si sintetizirime katar e T-celi, numaj si absorbime katar o TME so si paše. E eksperimentura in vitro sikaven kaj e T-celulen si len tendinca te akumulirinen ekzogeno MNA.
Amare in vitro studie sikade kaj o exogeno MNA induciril e ekspresia e TNFα ande T-celulen thaj vazdel o phanglipe e Sp1-esko e TNFα promotorosa. Vi te si ke o TNFα si les vi anti-tumor thaj vi anti-tumor funkcie, ando kancero e ovariengo, o TNFα śaj te promoviril o barjaripe e kancerosqo e ovariengo (31-33). I neutralizacia e TNFα-qi anθ-i kultura e tumorosqe ćhelurenqi anθ-e ovarìe vaj i eliminacia e signalosqi TNFα anθ-e modelură e śuśenqe śaj te laćharel i TNFα-mediaciaqi produkcia e inflamaciaqe citokinenqi thaj te inhibiril o barjaripen e tumorosqo (32, 35). Anda kodo, anθ-o kadava lil, o MNA kerdo katar o TME śaj te kerel buti sar jekh pro-inflamàciaqo metabolìto anθ-o jekh TNFα-dependènto mekanìzmo anθ-o autokrino ćàso, kadja te promovisarel o arakhipnasqo thaj o śerdipen e kancèrosqo anθ-o ovàro (31). Pe baza kadale śajutnimaski, i TNFα blokada si studirime sar jekh potenciàlo terapèutiko agento vaś o kancèro e ovarìenqo (37, 48, 49). Paše odova, o MNA phagel i citotoksicitàta e CAR-T ćhelurenqi karing e ćhelurenqe tumorosqe ovariàlo, so del maj but dośa vaś i MNA-mediaciaqi imunitèto supresia. Sa khetane, kadala rezultatura sikaven jekh modelo ande savo e tumorura thaj e CAF čelalja ćhiven avri MNA ande ekstracelularno TME. Prekal (i) TNF-inducirime stimulàcia e barvalipnasqi e kancerosqe e ovarienqi thaj (ii) MNA-inducirime inhibicia e T-celulenqi citotòksikani aktivitèta, kadava śaj te avel les jekh dujto efekto e tumorosqo (Figura 5D).
Sar konkluzia, aplikindoj jekh kombinàcia e śukar barvalipnasqi e ćhelurenqi, jekh ćhelurenqo sekvenciripe thaj metabolikano profiliripe, kadaja studia sikavdăs e bare imunometabolomikane diferencie maśkar e tumorură thaj e aśiteske ćhelură anθ-e HGSC nasvale. Kadi pherdo analìza sikavdăs ke si diferencie anθ-o glukozàqo astaripen thaj anθ-i mitokondriàlo aktivitèta maśkar e T-celulenqe, thaj identifikisardas o MNA sar jekh na-celulàro autonomo imuno-regulàciaqo metabolìto. Kadala date si len impakto pe kodo sar o TME afektil o metabolizmo e T-celulenge ande manušikane kancerura. Vi te si raportirime i direktno kompetìcia vaś e nutrientură maśkar e T-celulen thaj e kancerosqe ćhelură, e metabolìtură śaj vi te keren buti sar indirekto regulatorură te promovisaren i progresia e tumorosqi thaj śaj te phanden e endogene imunitetosqe respònse. O maj dur deskripcia e funkcionalno rola kadale regulatorno metaboliturengi shaj te putarel aver strategie vash te vazdel o anti-tumor imunitetosko responso.
E nasvalengo specimenura thaj e klinikane date sas line katar o BC kancerosko tumorosko tissue repozitoriumo certificirime katar o Canadian Tissue Repository Network. Palal o protokolo aprovisardo katar o BC Cancer Research Ethics Committee thaj o University of British Columbia (H07-00463), sa e nasvalenqe specimenură thaj e klinikane date line informisardo xramosardo somdaśimos vaj formalo dine lenqo somdaśimos. E mostre si garavde ano certificirimo BioBank (BRC-00290). E detalura e nasvalenqe karakteristike si sikavde anθ-e Tabele S1 thaj S5. Palal i krioprezervàcia, jekh skalpèlo si utilizisardo te dekompozisarel mekanikanes o tumorosqo egzàmplo e nasvalesqo thaj palal kodoja te ćhivel les anθ-o 100-mikronosqo filtro te ovel jekh suspenzia jekhe ćhelurenqi. O ascites e nasvalesko sas centrifugirimo ko 1500 rpm 10 minutia ko 4°C te kerel pes e ćhelura thaj te lel pes o supernatanto. E selie save si line katar o tumoro thaj o ascite sas krioprezervirime ande 50% AB serum (Sigma-Aldrich), 40% RPMI-1640 (Thermo Fisher Scientific) thaj 10% dimetil sulfoksido. Kadala prezervirime jekhe ćhelurenqe suspenzie sas ćhivde thaj utilizirime vaś e metabolomika thaj e metabolitoski determinacia deskriptime maj tele.
O pherdo mediumo si kerdo kotar 0.22 μm filtrime 50:50 pherdo RPMI 1640: AimV. RPMI 1640 + 2.05 mM l-glutamine (Thermo Fisher Scientific) pherdo 10% tato-inaktivime manušikane AB serumosa (Sigma-Aldrich), 12.5 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific), 2 mM l-glutamine (Thermo Fisher Scientific) x1 Penicilin Streptomycin (PenStrep) solucia (Thermo Fisher Scientific) thaj 50 μMB-mercaptoethanol. AimV (Invitrogen) si pherdo 20 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific) thaj 2 mM l-glutamine (Thermo Fisher Scientific). O bufèro vaś o koloripen e citometrosqo sas kerdo anθar 0.22μm filtrime fosfato bufèro saline (PBS; Invitrogen) pherdo 3% AB manuśesqo serum (Sigma) inaktivime katar i toplina. O buferi vash o barvalipe e celulengo si kerdo kotar 0.22μm filtrime PBS thaj pherdo 0.5% manushikane AB serumosa (Sigma-Aldrich).
Ano 37°C kompleto mediumo, e selie sas kolorime 10 nM MT DR thaj 100 μM 2-NBDG 30 minutia. Palal, e ćhelura sas farbime e źivdipnaske bojaça eF506 k-i 4°C vaś 15 minutură. Resuspendisar e ćhelura anθ-o FC Block (eBioscience) thaj anθ-o Brilliant Stain Buffer (BD Biosciences), diluisaren len anθ-o flow cytometer staining buffer (palal e instrukcie e fabrikantosqe), thaj inkubirinen len 10 minutură anθ-i temperatura e sobake. Phenen e ćhelura jekh set antitela (Tabela S2) anθ-o bufèro e rangǎripnasqo e citometriaqo anθ-o 4°C vaś 20 minutură. Resuspendisar e ćhelura anθ-o bufèro e koloripnasqo e citometriaqo (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R konfiguracia) anglal i analìza. Keren buti e SpectroFlo thaj FlowJo V10 te analizirinen e data e ginavipnaski e ćhelurenqi, thaj utilizin o GraphPad Prism 8 te keren e date. I mediani fluorescencaki intenziteta (MFI) e 2-NBDG thaj MT DR sas log-normalizirime, thaj palal kodoja sas kerdo jekh parno t-testo vaś statistikani analìza te śaj te lel pes sama e paśiènturǎ save sas phangle. Te len sa e populacie saven si maj tikno katar 40 evenimentura katar i analìza; thov jekh MFI valuàcia 1 vaś sa e negativne valutură anglal te keres statistikani analìza thaj vizualizàcia e datengo.
Te śaj te pheras i stratègia e manuàlo phanglimaski katar o opruno proceso panelo, amen hasnisaras i sasti anotàcia katar o kasht e restrikcienqo e formeqo (FAUST) (21) te śaj te asignisaras e ćhelură automatikane e populaciaqe palal o xasaripen e mule ćhelurenqo anθ-o FlowJo. Amen manualno menadžirisaras o rezultato te ćhivas e populacie save dikhen pes sar te aven bilačhe alosarde (kombinirindoj PD1+ e PD1-tumoroske čelalenca) thaj e populacie save si arakhle. Sako egzàmplo si les jekh prodùso maj but sar 2% ćhelură, vaś jekh totalo 11 populacie.
I Ficoll gradient density centrifugacia sas kerdini te ulavel pes o PBMC katar e leukocyte separaciake produktura (STEMCELL Technologies). CD8 + T ćhelura sas izolime katar o PBMC labǎrindoj CD8 MicroBeads (Miltenyi) thaj barjarde anθ-o pherdo maśkar labǎrindoj TransAct (Miltenyi) vaś 2 kurke palal e instrukcie e fabrikantosqe. E ćhelura sas mukhle te beśen 5 divesa anθ-o pherdo maśkar savo sas les IL-7 (10 ng/ml; PeproTech), thaj palal kodoja sas pale stimulime e TransAct-eça. Pe 7-to dives, palal e instrukcie e fabrikantosqe, e manuśkane CD45 MicroBeads (Miltenyi) sas utilizirime te barvaren e ćhelura anθ-e trin śerutne ćàsură. E ćhelura sas alosarde vaś i analìza e citometriaqi e ćhibăqi (sar si deskripto opral), thaj jekh miliono ćhelură sas alosarde trinvar vaś i analìza e LC-MS/MS. E mostre sas procesuime kotar LC-MS/MS sar so si deskriptirime telal. Amen estimisardam o xasardo metabolitosko gin e jonengo 1,000. Sako egzàmplo si normalizirime katar o totalo gin e ionenqo (TIC), logaritmikane konvertirime thaj automatikane normalizirime anθ-o MetaboAnalystR anglal i analìza.
I suspenzia e jekhe ćhelurenqi vaś svako nasvalo sas ćhivdi thaj filtrime anθ-o jekh 40 μm filtro anθ-o pherdo maśkar (sar si deskripto opral). Palal o protokolo e fabrikantosqo, trin śerutne runde e pozitìvo selekciaqe katar e magnetikane perlenqi separacia labǎrindoj e MicroBeads (Miltenyi) sas utilizirime te barăren e mostre vaś e CD8+, CD4+ thaj CD45- ćhelură (pe glazura). Ko skurto, e selie si resuspendime ano buferi vash o barvalipe e seliengo (sar so si deskriptirime opral) thaj ginavde. E ćhelura sas inkubirime e manušikane CD8 perlenca, manušikane CD4 perlenca vaj manušikane CD45 perlenca (Miltenyi) ko 4°C 15 minutura, thaj palal kodoja sas thodine e buferosa vaś o barvalipe e ćhelurenqo. O egzàmplo si nakhlo anθ-i LS kolona (Miltenyi), thaj e pozitìvo thaj e negativo frakcie si kidine. Te śaj te tiknjarel pes i duripe thaj te barjarel pes o paso e ćhelurenqo, i CD8-frakcia si palal kodoja utilizirime vaś o dujto ćàso e CD4+ barvalipnasqo, thaj i CD4-frakcia si utilizirime vaś o maj palal CD45-barvalimos. Te arakhel pes i solucia pe glazura anθ-o sasto proceso e separaciaqo.
Te gatisaren pes e mostre vaś i analìza e metabolitosqi, e ćhelǎ sas thodine jekhvar anθ-i solucia e śukar śukar śukar, thaj 1 ml 80% metanol sas thodino anθ-e svako mostre, palal kodoja sas thodino anθ-o vortex thaj sas ćhivdo anθ-o śukar azoto. E mostre sas thodine trin ćàsurǎ te ćhiven pes anθ-o ćhivipen thaj sas centrifugime anθ-o 14,000 rpm vaś 15 minutură anθ-o 4°C. O supernatanto savo si les e metabolitura si te ćhivel pes avri źi kana si śukar. E metabolitura sas pale ćhivde ande 50 μl 0.03% formikano acido, vortexirime te ćhiven pes, thaj palal kodoja centrifugime te len pes o ćororipe.
Xramosar e metabolitură sar si deskripto opral. Transferisar o supernatanto anθ-i jekh buti e śukar kromatografiaqi e śukar performancaqi vaś o rodipen e metabolomikane. Keren buti e randomizirime tretmanoske protokolosa te tretirinen svako proba e similarno numerosa e čelalencar te arakhen pes e efektura e grupake. Amen kerdjam jekh kvalitativno dikhipe e globalno metabolitengo publicirimo maj anglal ko AB SCIEX QTRAP 5500 Triple Quadrupole Mass Spectrometer (50). Kromatografikani analìza thaj integràcia e śeresqi sas kerde anθ-o MultiQuant verzia 2.1 softwèro (Applied Biosystems SCIEX).
Jekh gin e ionenqo 1000 sas kerdo te śaj te ginavel pes o xasaripen e metabolitosqo, thaj o TIC vaś svako proba sas kerdo te ginavel pes i normalizirime rig e śeresqi vaś svako detektime metabolito te laćharel pes e paruvimata introducime katar i instrumentalo analìza katar o procesiripe e mostresqo. Palal so o TIC si normalizirime, o MetaboAnalystR(51) (paramètro standardo) si kerdo vaś i logaritmikani konverzia thaj o automatikano śerutno śerutno śerutno. Amen hasnisaras PCA e vegan R paketosa te keras eksplorativno analìza e metabolome diferencienqi maśkar e tipuria e mostrenqe, thaj hasnisaras parśalo redundancaqi analìza te analizisaras e nasvalen. Keren buti e Ward metodasa te keren jekh dendrogramo e toplinako karte te keren grupa e Euklidesqi distanca maśkar e mostre. Amen hasnisaras limma (52) pe standardizirime buteder metabolitora te identifikisaras diferentno buteder metabolitora kotar o sasto tip e ćhelurenqo thaj mikroambiento. Te śaj te keras maj lokho i eksplikàcia, amen hasnisaras o paramètro e grupaqo maśkar te specifikisaras o modelo, thaj te dikhas e ćhelurenqe tipuria anθ-o mikroambiento sar svako grupa (n = 6 grupe); vaś o test e signifikanciaqo, kerdăm trin repeticiaqe mesura vaś svako metabolito Te na avel xoxamni replikacia, o nasvalo sas andre thodino sar jekh obstakulo anθ-o limma dizajno. Te śaj te dikhel pes e diferencie anθ-e metabolìtură maśkar e diferentne nasvale, ame ćhinadam o limma modelo inkluziv e nasvalen anθ-jekh fixno drom. Amen raportisaras o signifikànto e anglal-specifikuime kontrastosqo maśkar o tip e ćhelurenqo thaj o mikroambiento e Padj <0.05 (Benjamini-Hochberg korekcia).
Palal o barvalipe e zorako labǎrindoj o Miltenyi Dead Cell Removal Kit (>80% viàbilitèta), o sekvenciripe e transkriptòmosqo jekhe ćhelurenqo sas kerdo pe sa e źivde ćhivde ascites thaj e tumorosqe mostre labǎrindoj jekh 10x 5′gene ekspresiaqo protokolo. Pandž kazura saven sas tumorura thaj ascites save si phangle sas analizime, źi kaj i tikni źivdipe katar jekh tumorosko egzàmplo naśti te avel andre thodi. Te śaj te aresel pes but selekcie e nasvalenqe, amen kombinisaras e mostre katar svako nasvalo anθ-e riga e 10x kontroloresqe e kromosqe, thaj analizisaras e thana e ascitesqe thaj e tumorosqe averhande. Palal o sekvenciripe [Illumina HiSeq 4000 28×98 bp parno agor (PE), Quebec genomo; jekh prodùso 73,488 thaj 41,378 ginavimata anθ-i jekh ćàla vaś o tumoro thaj o ascites]], ame hasnisaras CellSNP thaj Vireo (53) (bazirime p-o CellSNP sar O śerutno manuśikano SNP (VCF) dino kaθar o GRCh38 si dino jekh donatoresqo identiteto. Amen hasnisaras SNPRelate te inferisaras o maj paśutno identitèto (IBS) e paśièntosqo (IBS) genotip bi te lel pes sama e na-asignime čelalja thaj e čelalja save si identifikuime sar dupleksora thaj e donatorura save si phangle maškar e ascites thaj e tumoroske mostre (54 Pe baza kadale butjaki, amen arakhlam trin kazura saven sas but čelaljaki reprezentacia ando tumoro thaj ascites vash analiza telal o pani. (2792 thaj 4183 ćhelura katar o tumoro thaj o ascites, respektivno) vaś i analìza Amen hasnisaras igraph-esqi (57) Louvain-esqi grupàcia e maj paśutne netvorkoski (SNN) bazirime p-i distanca e Jaccard-esqi karing e ćhelură e grupenqe pal-i ekspresia. e ćhelura si definime katar i ekspresia e CD8A thaj GZMA, bi te len sama e subgrupe saven si len tikni ekspresia e ribosomalno proteinenqi. Amen reslam e publikime date katar o Izar et al.
PBMC sas separime katar e produktura katar e leukocyte separacia (STEMCELL Technologies) katar e Ficoll gradient density centrifugation. CD3 + ćhelura sas izolime katar o PBMC labǎrindoj CD3 perle (Miltenyi). Ano than vaj bi MNA, e CD3+ čelalja sas aktivirime e CD3 (5μg/ml), CD28 solubilno (3μg/ml) thaj IL-2 (300 U/ml; Proleukin). Pe paluno dives e ekspanziaqo, i śajmata (Fixable Viability Dye eFluor450, eBioscience) thaj i proliferàcia (123count eBeads, Thermo Fisher Scientific) sas evaluime katar i citometria e ćhibăqi. Evaluisaren e efektoresqi funkcia stimulindoj e ćhelură PMA (20 ng/ml) thaj ionomycina (1μg/ml) e GolgiStop-eça 4 òre, thaj monitorisaren CD8-PerCP (RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700 (RPA-T4) , BioLegend) thaj TNFα-fluoresceinsothianate (TCMA-1) BD). Stimulisaren e qPCR thaj e ChIP čela PMA (20 ng/ml) thaj ionomycin (1μg/ml) 4 čhona. O ELISA supernatanto sas kidino anglal thaj palal i stimulacia e PMA-sa (20 ng/ml) thaj ionomycin-esa (1 μg/ml) 4 òre.
Palal o protokolo e fabrikantosqo te izolisaren o RNA labǎrindoj o RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN). Ker buti e QIAshredder (QIAGEN) te homogeniziris o egzàmplo. Keren buti e bare kapacitetosa RNA ko cDNA kit (Thermo Fisher Scientific) te keren sinteza e komplementarno DNA (cDNA). Utilizisar o TaqMan Rapid Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific) te kvantifikisarel pes i ekspresia e genengi (palal o protokolo e fabrikantosqo) e śerutne sondença: Hs00196287_m1 (NNMT), Hs00154079_m1 (AOX1), Hs004275515S (AOX1), Hs02786624_g1 [glyceraldehyde-3-phosphate off Hydrogen (GAPDH)] thaj Hs01010726_m1 (SLC22A2). E mostre sas kerde pe StepOnePlus real-time PCR sistemo (Applied Biosystems) (Applied Biosystems) ande MicroAmp fast optical 96-well reaction plate (Applied Biosystems) e MicroAmp optikane filmosa. Sako Ct-esko vaxt savo nakhela 35 si konsiderime sar opral o prago e detekciaqo thaj si markisardo sar na-detektibilno.
Keren o ChIP sar so sas maj anglal deskriptirime (58). Ko skurto, e seli sas tretirime e formaldehidosa (agorutni koncentracia 1.42%) thaj inkubirime ki temperatura e sobake 10 minutia. Utilizisar o bufèro vaś o śukaripen (25 mM Hepes, 1.5 mM MgCl2, 10 mM KCl thaj 0.1% NP-40) pe glazura vaś 10 minutură, palal kodoja te resuspindis les anθ-o bufèro vaś o imunoprecipitacia sar si deskripto (58 ). O egzàmplo sas palal kodoja sonikuime kadale ćàsurenθar: 10 ćàsurǎ (20 1-sekundosqe pulsurǎ) thaj jekh statikano vaxt 40 sekundǎ. Inkubirinen ChIP-grade immunoglobulin G (Cell Signaling Technology; 1μl), histone H3 (Cell Signaling Technology; 3μl), NFAT (Invitrogen; 3μl) thaj SP1 (Cell Signaling Technology; 3μl) antitela e mostrenca ko 4°CC ćhiven len sasti rat. Inkubirinen e proteina A perle (Thermo Fisher Scientific) e mostresa ko 4°C tikno ćhivindoj len 1 ćàso, palal kodoja utilizin e chelex perle (Bio-Rad) te barvaren o DNA, thaj utilizin e proteinaza K (Thermo Fisher) vaś o xabe e proteinenqo. O TNFα promotoro sas arakhlo katar o PCR: anglal, GGG TAT CCT TGA TGC TTG TGT; pe kontra, GTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG (207-bp produkto). E slike sas kerde kotar o Image Lab (Bio-Rad) thaj kvantifikuime kotar o softveri ImageJ.
O supernatanto e kulturako e ćhelurenqo sas kidino sar si deskripto opral. I determinàcia sas kerdini palal e procedure e fabrikantosqe vaś o manuśikano TNFα ELISA kit (Invitrogen), o manuśikano IL-2 ELISA kit (Invitrogen) thaj o manuśikano IFN-γ ELISA kit (Abcam). Palal o protokolo e fabrikantosqo, o supernatanto sas diluime 1:100 te arakhel pes o TNFα thaj o IL-2, thaj 1:3 te dikhel pes o IFN-γ. Ker buti e EnVision 2104 Multilabel Reader (PerkinElmer) te meśes i absorbàcia ko 450 nm.
PBMC sas separime katar e produktura katar e leukocyte separacia (STEMCELL Technologies) katar e Ficoll gradient density centrifugation. CD3 + ćhelura sas izolime katar o PBMC labǎrindoj CD3 perle (Miltenyi). Ande prezenca vaj bi-aźutipe e MNA-qo, e CD3+ ćhelură sas aktivisarde e CD3-eça (5μg/ml), CD28-eça (3μg/ml) thaj IL-2-eça (300 U/ml; Proleukin) vaś 3 divesa. Palal 3 divesa, e ćhelura sas kidine thaj thodine 0.9% saline, thaj o peleto sas sigo ćhivdo. O gin e ćhelurenqo sas kerdo anθ-i citometria e ćhibăqi (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R konfiguracia) labǎrindoj 123count eBeads.
Xramosar e metabolitură sar si deskripto opral. O suxo ekstrakto sas rekonstituime ki koncentràcia 4000 ćhelurenqe ekvivalentură/μl. Analizisaren o egzàmplo anθ-i kromatografia anθ-i faza (1290 Infinity II, Agilent Technologies, Santa Clara, CA) thaj CORTECS T3 kolona (2.1×150 mm, partikulaqo barodipen 1.6-μm, porengo barodipen 120-Å; #186008500, Waters). Polarno masako spektrometro (6470, Agilent), kote so o elektrospray ionizàcia kerel buti anθ-o pozitìvo modo. I mobilno faza A si 0.1% formic acid (ande H2O), mobilno faza B si 90% acetonitril, 0.1% formic acid. O LC gradiènto si 0 źi ka 2 minutură vaś 100% A, 2 źi ka 7,1 minutură vaś 99% B, thaj 7,1 źi ka 8 minutură vaś 99% B. Palal kodoja, re-ekilibrisarel i kolona e mobilno fazaça A anθ-i jekh ćhib 0,6 ml/min vaś 3 minutură. . O ćhivipen si 0.4ml/min, thaj i kolona si tato źi ko 50°C. Utilizisar o MNA-esqo standardo vaś e ćhibăqe ćhibăqe (M320995, Toronto Research Chemical Company, North York, Ontario, Canada) te śaj te ćhives o vaxt e arakhipnasqo (RT) thaj i transformàcia (RT = 0.882 minutură, transformàcia 1 = 137→94.1, transformàcia 2 = 137→92 , Konverzia = 13→77). Kana sa e trin tranzicie kerdjon ko ćaćutno vaxt e arakhipnasqo, i tranzicia 1 si kerdini vaś kvantifikàcia te sigurisarel pes i specifikàcia. I standardo kurva e MNA (Toronto Research Chemical Company) sas kerdini katar śov seriàlo dilucie e stock soluciaqe (1 mg/ml) te ovel standardo 0.1, 1.0, 10 thaj 100 ng/ml thaj 1.0 thaj 10 μg/ml respektivno likvido. O limito e detekciaqo si 1 ng/ml, thaj o linearno atùnćipen si maśkar 10 ng/ml thaj 10μg/ml. Sako injekcia duje mikrolitrurenqi e probaqi thaj standardosqi si kerdini vaś LC/MS analìza, thaj jekh miksardo probaqo kontrolo e kvalitetosqo si kerdo sako oxto injekcie te avel sigurime i stabilitàta e analìzaqe platformaqi. E MNA-esqe respònse sa e MNA-tretirime ćhelurenqe mostrenqe sas and-o linearno spektro e anàlizaqo. I analìza e datengo sas kerdini anθ-o softwèro MassHunter (v9.0, Agilent).
O dujto generaciako αFR-CAR konstrukto sas lino katar o Song et al. (59). Ko skurto, o konstrukto si les kadala sasto: CD8a lider sekvenca, manušikani αFR-specifično jekh-lanco varijabilno fragmento, CD8a šarnira thaj transmembransko regiono, CD27 intracelularno domeni thaj CD3z intracelularno domeni. I sasti CAR sekvenca sas kerdini katar o GenScript, thaj palal kodoja sas klonime anθ-o dujto-generaciaqo lentiviralno ekspresiaqo vektòro opral e GFP ekspresiaqi kaseta savi sas labărdi te evaluisarel i transdukciaqi efikasità.
O lentivirus si kerdo katar e transfekcia e HEK293T celienge [American Type Culture Collection (ATCC); barjardo ano Dulbeccosqo modifikuime Eagle mediumo savo si les 10% fetalno bovino serum (FBS) thaj 1% PenStrep, thaj utilizisardas CAR-GFP vektor thaj E plazmidura (psPAX2 thaj pMD2.G, Addgene) utilizin lipofection amine (Sigma-Aldrich). O supernatanto savo si les o viruso sas kidino 48 thaj 72 chasura palal i transfekcia, filtrime thaj koncentrime ultracentrifugàciaça. Te garavel pes o koncentrime viralno supernatanto ko -80°C źi ko transdukcia.
PBMC si separime katar e saste donatorenge leukocitengo separàciaqe produktură (STEMCELL Technologies) katar i Ficoll gradient density centrifugation. Keren buti e CD8 mikroperle (Miltenyi) save si len pozitìvo selekcia te izolisaren e CD8+ ćhelǎ katar o PBMC. Stimulisaren e T-celulen TransAct (Miltenyi) thaj ando TexMACS mediumo [Miltenyi; pherdo 3% manušikane serumosa inaktivirime katar e toplina, 1% PenStrep thaj IL-2 (300 U/ml)]. Biš thaj štar chasura palal i stimulacia, e T-celulen sas transducirime e lentivirusosa (10 μl koncentrime virusosko supernatanto pe 106 celi). 1 źi ka 3 divesa palal i transdukcia pe Cytek Aurora (pe FSC (Forward Scatter)/SSC (Side Scatter), Singlet, GFP+), evaluisaren i GFP ekspresia e ćhelurenqi te sikaven jekh transdukciaqi efikasità maj tikno 30% .
E CAR-T ćhelura sas kultivirime 24 ćàsura anθ-o Immunocult (STEMCELL Technologies; pherdo 1% PenStrep) anθ-e kadala kondicie: bi-tretirime, tretirime 250 μM adenozin vaj 10 mM MNA. Palal o angluno tretmano, e CAR-T ćhelura sas thodine e PBS-esa thaj kombinime e 20,000 SK-OV-3 ćhelurenca [ATCC; ano McCoy 5A mediumo (Sigma-Aldrich) pherdo 10% FBS thaj 1% PenStrep ko 10: O raporto e efektoresko thaj o targeto 1 sas amplificirimo ano trin drom ano pherdo Immunocult mediumo. SK-OV-3 čelalja thaj SK-OV-3 čelalja lizirime e digitalis saponinasa (0.5mg/ml; Sigma-Aldrich) sas hasnime sar negativne thaj pozitivne kontrole, respektivno. Palal 24 òre ko-kultivacia, o supernatanto sas kidino thaj i laktat dehidrogenaza (LDH) sas mesurime palal e instrukcie e fabrikantosqe (LDH Glo Cytotoxicity Assay Kit, Promega). O LDH supernatanto sas diluime 1:50 ano LDH buferi. O procento e mudarimasqo sas merimo anθ-i formula: procento e mudarimasqo = procento e korekciaqo / maj baro mudaripnasqo procento x 100%, kaj o procento e korekciaqo = ko-kultura-T-celulenqe numaj, thaj maj baro mudaripnasqo procento = pozitìvo kontrolo-negativo kontrolo.
Sar si deskriptirime ano tèksto vaj anθ-e materiàlurǎ thaj anθ-e metode, labăren o GraphPad Prism 8, Microsoft Excel vaj R v3.6.0 vaś i statistikani analìza. Te si ke but mostre si kidine katar o sasto nasvalo (sar so si o ascite thaj o tumoro), amen hasnisaras jekh parno t-testo vaj inkludisaras o nasvalo sar jekh randomizirime efekto ande jekh linearno vaj generalizirime modelo sar si lačho. Palal i analìza e metabolòmikaqi, o testò e importancaqo si kerdo anθ-e trin lila.
Palal maj but materiàlură vaś kadava lil, mangas tumen te dikhen http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1
Kado si jekh putardo akceso artiklo distribùime telal e kondicie le Creative Commons Attribution-Non-Commercial License, savo del śajsaripen te labărel pes, te del pes thaj te kerel pes reprodukcia anθ-e savi-te-avel medium, źi kana o agorutno labăripen na si vaś komercialno laćhipen thaj i premisa si ke i originalo buti si ćaći. Referìnca.
Nota: Amen mangas tumendar numaj te den tumari e-mail adresa, kadja kaj o manuš savo rekomendisaren les ki rig te džanel kaj kamen te dikhen o e-mail thaj kaj na si spam. Amen na ka astaras nisave e-mail adrese.
Akava pućhipen si kerdo te testisarel pes te san vizitanto thaj te arakhel pes o automatikano bićhaldipen e spam-esqo.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson), Ralph J. Dephrini (R.R.R. Bellnis), Deraldinis. Jones (Russell G. Jones), Phineas T. Hamilton (Phineas T.
MNA del kontribucia ki imunitetosko supresia e T-celulenge thaj reprezentil potencijalno imunoterapijako ciljo vash o tretmano e manushikane kancerosko.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson), Ralph J. Dephrini (R.R.R. Bellnis), Deraldinis. Jones (Russell G. Jones), Phineas T. Hamilton (Phineas T.
MNA del kontribucia ki imunitetosko supresia e T-celulenge thaj reprezentil potencijalno imunoterapijako ciljo vash o tretmano e manushikane kancerosko.
©2021 Amerikani Asociàcia vaś o Anglunipe e Scienciaqo. sa le hakaja si garavde. AAAS si partneri e HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef thaj COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.