O ćhivipen e proteinenqo anθ-o drom e sekretòrosqo si esenciàlo vaś te arakhel pes i kompartimentàcia e ćhelurenqi thaj i homeostaza. Po dur katar o śel-mediaciaqo ćhivipen, i ròla e lipidenqi anθ-o ćhivipen e kinesinosqo anθ-o proceso e sekretorikane transportosqo si jekh but berśenqo bazako pućhipen savo inke na sas dino atùnći. Kathe, keras 3D simultàno butkoloro baro-rezoluciaqo realo-vràmaqo dikhipen te sikavas in vivo ke neve sintetizirime glikozilfosfatidilinositol-imobilizirime proteine ​​but lunge ceramide lipidne kotorenca si grupime thaj klasifikuime anθ-e specializirime endoplazme Net exit site, savo si aver katar kodola proteinură save si labărde katar e transmembrana. Paše odova, sikavas kaj i lungina e lancoski e ceramideski ki membrana e endoplazmatikane retikulumoski si kritikano vash akava selektiviteto e sortiribasko. Amari studia del o angluno direktno in vivo evidencia te klasificirinel e proteinenge kargo bazirime pe lipidno lanco lungipe ande selektivno exportoske thana ande sekretorno drom.
Ano eukariotikane čelalja, e proteine ​​sintetizirime ano endoplazmatično retikulo (ER) si palo odova čhinavde ano transporto prekal o sekretorno drom vash te bičhalen pe olengere adekvatno čelaljakere destinacie (1). Po dur katar o ćhivipen kerdo katar o śero, sas but vràma spekulime kaj varesave lipidura śaj te aven vi sar selektìvo punktură vaś o iklǒvipen kana ćhiven len anθ-e specifikane membranàqe domenură sar specifikane proteinură (2-5). Numaj, isi panda jekh bi-aźutipe e direktno in vivo evidenciaqo te sikavel pes kadava śajdo mekanìzmo bazirime pe lipidǎ. Te śaj te laćharas kadava bazako problèmo, ame studirisardam anθ-o droźdo sar e glycosylphosphatidylinositol (GPI) ankrutne proteine ​​(GPI-APs) si diferentno eksportisarde katar o ER. GPI-APs si jekh varietèta lipid-konektime proteinurenqi anθ-i ćhelurenqi rig ( 6, 7). GPI-AP si jekh sekretirime proteina phangli e avrune lila e plazma membranake prekal o glikolipidno kotor (GPI ankro). Von akceptuin e GPI ankrura sar konservativno post-translaciake modifikacie ando ER lumen (8). Palal o phanglipe, o GPI-AP nakhela kotar o Golgi aparato (5, 9) kotar o ER ki plazma membrana. I prezenca e GPI ankrengi kerel o GPI-AP te avel transportirimo separatno katar e transmembranake sekretirime proteine ​​(inkluzivno aver plazma membranake proteine) po drom e sekretirime (5, 9, 10). Ano kvasno ćhelura, GPI-APs si separime katar aver sekretirime proteine ​​ano endoplazmatikano retikulo, thaj palo odova si phangle ano unikalune vesikula phangle kotar o protein komplekso II (COPII) (6, 7). E determinantura kadale klasifikaciake procesosko ando ER exportosko proceso si na-klare, numaj si spekulirime kaj akava mehanizmo shaj te mangel lipidura, maj but o strukturalno remodeliribe e lipidno kotoresko katar o GPI ankro (5, 8). Ano kvas, o GPI lipidno remodeliribe kezdisarel pes sigo palo GPI phanglo, thaj ano but thana, kerel e ceramida te phandel pes ko 26-karbon lungo-lanco saturime masno acido (C26:0) (11, 12). C26 ceramide si o maj baro ceramide kerdo katar e kvasne čelalja dži akana. Si sintetizirime ano ER thaj maj but olestar si eksportirimo ko Golgi aparato prekal COPII vesikula (13). O ER exporto e GPI-AP-esko specifično mangel te kerel pes sinteza e ceramideski (14, 15), thaj palal, i konverzia e ceramideski ko inositol fosfat ceramide (IPC) ko Golgi aparato dependil kotar e GPI ankro sinteza (16). Biofizikane studie e artificialne membranenca sikade kaj but lunge acyl lancoske ceramide shaj te keren jekhipe te keren ordino domeni e unikalune fizikane proporciencar (17, 18). Kadala date anen i hipoteza kaj o C26 ceramide thaj o GPI-AP e C26 ceramidesa utilizin pire fizikane proporcie te maladjon ande ordino regionura vaj regionura ande relativno čorro ER membranako lipidno ambienti. Si maj but kerdo katar skurto thaj na-saturime glicerolipidura (C16:1 thaj C18:1) (19, 20). Kadala regionura ka oven selektivno fokusirime pe specifična ER-esqe thana (ERES), kote so o ceramide thaj o ceramide-bazirime GPI-AP śaj te aven ko-transportirime ko Golgi anθ-i sasti dedikuime COPII vesikula (5).
Anθ-i kadaja studia, ame direkto testisaras kadava mekanìzmo bazirime pe lipidǎ labǎrindoj i super-rezoluciaqi konfokalno real-time imaging microscopy (SCLIM), savi si jekh avant-garde mikroskopiaqi tèknika savi śaj te dikhel simultàno e fluorescentno etiketirime proteinură.
Amen angluno drom kerdam SCLIM teknologia te maj dur definisaras sar o normalo GPI-AP e C26 ceramide grupasa sas skrinime katar e transmembrana sekretirime proteine ​​palal so mukhle o ER ande S. cerevisiae. Te śaj te dikhel pes i klasifikàcia e ER-esqi, ame hasnisaras jekh genetikano sistemo savo śaj te vizualizil direkto neve sintetizirime kargo savo del andre ando ERES in vivo (7, 23). Sar kargo, alosardam C26 ceramide-bazirime GPI-AP Gas1 markirime e zeleno fluorescentno proteinasa (GFP) thaj transmembrana sekretirime proteina Mid2 markirime e pashe-infrarudo fluorescentno proteinasa (iRFP), save duj si phangle e plazma membranasa (24–26). Ano sec31-1 temperatura-sensitivno mutanto, akala duj kargo si ekspirime telal jekh galaktoza-inducibilno promotori thaj jekh konstitutivno ERES markeri. Ki ekstremo temperatura (37°C), soske i sec31-1 mutàcia afektisarel i funkcia e COPII-esqi komponenta Sec31 te inhibiril o COPII-esqo ćhivipen thaj o ER-esqo eksporto, o nevo sintetizirime kargo akumulisarel pes an-o ER (23). Palal o ćhivipen źi k-i tikni temperatura (24°C), e sec31-1 mutantne ćhelură arakhline pes katar o sekretorikano than, thaj o akumulime nevo sintetikano kargo astarda te avel avri bićhaldo katar o ER. I CLIM vizualizàcia sikavdăs ke maj but katar o nevo sintetizirime Gas1-GFP thaj Mid2-iRFP inke akumulisarde pes anθ-o ER e sec31-1 mutantne ćhelurenqo palal i inkubacia k-o 37°C thaj palal kodoja sas mukhle k-o 24°C vaś 5 minutură (Figura 1). Sar so o Mid2-iRFP si distribuime pe sasti ER membrana, thaj o Gas1-GFP si koncentrime thaj kidino ki diskontinuime ER membranaki rig, lengi distribucia si pherdo aver (Figura 1, A ji ko C thaj Filmo S1). Paše odova, sar si sikavdo ki Figura 1D, o Gas1-GFP klastero nane les Mid2-iRFP. Kadala rezultatura sikaven kaj o GPI-AP thaj e transmembraneske proteine ​​sas ulade ande diferentne ER membranake regionura maj anglal. O Gas1-GFP klastero si paśal jekh specifiko ERES markisardo e mCherry-esqe COPII proteina Sec13 (Figura 1, E thaj F, thaj filmo S1) (23).
sec31-1 sec31-1 ćhelura sikaven galaktoza-inducirime sekrecie, jekh lungo acil lanco (C26) ceramide GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, zeleno) thaj o transmembrano proteino Mid2-iRFP (TMP, lole) thaj akava Konstruktivo ERES markeripe Sec13-mCherry (E) sas inkubirime ko RES3°C, 30 minutia, ćhudino ko 24°C, thaj kerdo kotar o SCLIM 5 minutia maj palal. (A ji ko C) sikavel jekh reprezentativo phanglo vaj jekh 2D dikhipe e planosqo (A), jekh 2D projekciaqo dikhipen e 10 z-sekcienqo (B) vaj jekh 3D ćhibăqo ćhibăqo ćhibăqo ćhibăqo e kargo thaj ERES markerenqo (C). Skala 1μm (A thaj B). I skala si 0.551μm (C). O Gas1-GFP sas arakhlo ande diskretno ER regionura vaj grupe, kana o Mid2-iRFP sas arakhlo thaj distribuime ande sasti ER membrana (C). (D) O grafiko sikavel e relativno fluorescencijaki intenziteta e Gas1-GFP thaj Mid2-iRFP ano Gas1-GFP grupa kotar e parni strela (left). AU, arbitràro jekhipen. (E thaj F) reprezentisaren o 3D-esqo dikhipen savo kombinisarel e bută thaj e ERES-esqi marka. Gas1-GFP grupe sas arakhline paše o specifično ERES. I skala si 0.551μm. (F) I parni solidno strela sikavel o Gas1-GFP grupa asociirime e ERES-esa. O maśkar thaj o ćaćutno panelo sikaven o 3D-esqo barjardo dikhipen thaj jekh pherdo dikhipen e alosarde Gas1-GFP-esqo grupako.
I paśutni relacia maśkar o Gas1-GFP klastèro thaj jekh specifiko ERES sikavel ke o Gas1-GFP śaj te del andre ande selektivo ERES, so si aver katar i selektivitèta utilizirime kaθar o Mid2-iRFP te mukhel o ER. Te śaj te keras buti kadaja śajmata, ame kvantifikisaras o ERES raporto numaj vaś jekh vaj duj bută (Figura 2, A źi ka C). Amen arakhlam kaj maj but ERES (70%) si len numa jekh tip kargo. O fundono patreto kotar o Figura 2C sikavel duj tipicno egzamplura kotar o ERES numaj Gas1-GFP (Figura 1) ja numaj Mid2-iRFP (Figura 2). Ko kontrasto, aproksimativno 20% kotar o ERES isi len duj kargora save si preklopime ko jekh than. Arakhlo sas kaj nesave ERES (10%) sas len duj vrjama kargo, numa von sas izolime ande klaro diferentne thana. Anda kodo, kadi statistikani analìza sikavel ke palal so o ER si eksportisardo, o GPI-AP Gas1-GFP thaj o transmembràno kargo Mid2-iRFP si ulade anθ-e diferentne ERES (Figura 2D). Akaja efikasnost e sortiribaski si but konzistento e anglune biokemikane analizasa (6) thaj e morfologikane determinaciasa (7). Amen śaj vi te dikhas o phiripen e karantenaqo kargo savo del andre ando ERES (Figura 2E thaj Filmo S2). I figura 2E sikavel kaj numaj jekh tikno kotor e Gas1-GFP (panelo 3) vaj Mid2-iRFP (panelo 4) del andre ko ERES kotar jekh rig thaj si phandlo ko diskretno than. O panelo 5 kotar i Figura 2E sikavel kaj o Gas1-GFP thaj o Mid2-iRFP si varekana arakhline ko jekh ERES, numa von den andre kotar diferentno riga thaj si koncentrime ko diferentno regionia save shaj te reprezentinen diferentno COPII vesikula. Amen vi konfirmisaras kaj i dikhlini separacia thaj klasifikacia e C26 ceramide-bazirime GPI-AP Gas1 sar selektivno ERES si specifiko soske aver transmembranako sekreciako kargo, o GFP-markirime plazma membranako proteino Axl2 (27 ), sikavel similarno phiripe sar Mid2-iRFP. (Slika S1 thaj Filmo S3). O nevo sintetizirime Axl2-GFP si distribuime prekal i ER membrana sar Mid2-iRFP (Figura S1, A thaj B), thaj si ko-lokalizirimo e Mid2-iRFP-esa ko maj but ERES (Figura S1, B dži ko D). E panelura 1 thaj 2 katar e Figura 1. S1C sikavel duj tipicno egzemplura katar ERES kote so duj transmembraneske kargo si pe jekh than. Ano akala thana, o duj butja den andre ko ERES khetane (Figura S1E, Panel 3 thaj Filmo S3).
E sec31-1 ćhelura save sikaven galaktozake inducibilno sekrecie, Gas1-GFP (GPI-AP, zeleno) thaj Mid2-iRFP (TMP, lole) thaj konstitutivno ERES markizirime Sec13-mCherry (ERES, magenta) sas thodine ko 37 Palal inkubàcia 30 minutură ko °C 24 °C, ćhiven pes te ćhiven o sekreto thaj te blokisaren o imàgo e SCLIM-esa palal 20 minutură. (A ji ko C) Reprezentativno 2D projekciake slike (A; skala bar, 1μm) vaj 3D slike e hemisferake slike (B thaj C; skala jekhin, 0.456μm) e kargo thaj 10 z-sekcije markirime kotar ERES. O tikno panelo ko (B) thaj o panelo ko (C) sikaven procesirime slike te sikaven numaj e butja save si ko ERES (magenta) [Gas1-GFP (gri) thaj Mid2-iRFP (lokhes lole)]. (C) Putardi strela: ERES inkrel numaj jekh kotor kargo (1 źi ka 4). Lole strela: ERES si les segreguime tovaro (5). Parno solidno strelo: ERES savo si les ko-lokalizirime tovaro. Telal: O alosardo jekhutno ERES si les numaj Gas1-GFP (1) vaj Mid2-iRFP (2). Skala bar, 100 nm. (D) Kvantifikàcia e fotomikrografosqi deskriptisardi anθ-o (C). O procento e ERES-esqo savo si les numaj jekh śerutno (Gas1-GFP vaj Mid2-iRFP), śerutno śerutno thaj śerutno śerutno. Ano trin independentno eksperimentia, n=432 ano 54 čelalja. Bar e greśenqi = SD. Duj-rig bi-parno t-test. *** P = 0.0002. (E) 3D-esqo dikhipen e alosarde ERES-esqo e karantenaqo kargo markisardo e (C). Gas1-GFP (zeleno) (3) vaj Mid2-iRFP (lolo) (4) del andre ando ERES (magenta) katar jekh rig thaj si limitirime pe jekh tikno than andar o ERES. Varekana, e duj tipuria kargoske den andre ko jekh ERES (5) kotar i savi rig thaj si phanle ko jekh izolirimo than andar o ERES. Skala bar, 100 nm.
Palal, ame testisaras jekh hipoteza kaj o lungo acil lanco ceramide (C26) prezento ande ER membrana kerel o specifično grupipe thaj sortiripe e Gas1 ande selektivno ERES. Pe akava agor, amen hasnisaras jekh modifikuime kvasno shtampo GhLag1, kote so e duj endogene ceramide sinteze Lag1 thaj Lac1 sas paruvde kotar o GhLag1 (o Lag1 homologo e pamukesko), so resljarda jekh kvasno shtampo e cellenge membranako Ceramide shtampo maj skurto kotar o divlo tipo (Figura 3A) (Figura 3A) (28). I analìza e masesqe spektrometriaqi (MS) sikavdăs ke anθ-e śukar-tipǎ, 95% anθar o sasto ceramido si but lungo (C26) ćàso ceramido, kana anθ-o GhLag1, 85% anθar o ceramido si but lungo (C18 thaj C16). ), numaj 2% katar o ceramido si but lungo (C26) lanco ceramido. Vi te si e C18 thaj C16 ceramide e majbare ceramide arakhline ki GhLag1 membrana źi akana, i MS analìza konfirmisardas vi kodo kaj o GPI ankro e Gas1-GFP-esqo ekspirime anθ-o GhLag1 śtampo si les C26 ceramide, savo si komparabilno e lipidurenqe katar o ćororo. O kvaliteto si sa kodo (Fig. 3A) (26). Anda kodo, kado znachil ke o ceramide remodeling enzyme Cwh43 si but selektivo vash C26 ceramide, sar si sikavdo ande Figura 26, vov preferencijalno inkorporil o GPI ankro katar jekh tikno kotor C26 ceramide ande GhLag1 strain. S2 (29). Numaj, i membrana e ćhelurenqi e GhLag1-esqi si la numaj C18-C16 ceramide, kana o Gas1-GFP inke si la C26 ceramide. Akava fakto kerel akava shtampo te ovel idealno instrumento te šaj specifično te lačharel pes o problemo e acilno lancosko lungipe e membranake ceramidengo ko ER. I hipotetikano ròlo e klasaqo thaj e śerutnimatenqo. Palal, amen angluno drom studirisardam i śajmata e C26 Gas1-GFP te akumulisarel pes anθ-e grupe anθ-o GhLag1 e temperaturaqe-sensitivno mutanto alel sec31-1 anθ-i konvencionalo fluorescèncaqi mikroskopia, kaj numaj o lungo (C18-C16) lanco egzistil anθ-i ER membrana Ceramide (Fig. 3). Amen dikhlam kaj ko sec31-1, maj but kotar o Gas1-GFP sine koncentririmo ko grupe, a o Gas1-GFP ko sec31-1 GhLag1 lungo (C18-C16) lungo ceramide ER membrana sine maj but na grupirimo thaj distribuirimo ko sasto ER membrana. Te ovel precizno, soske o C26 ceramide-bazirime grupipe si pashe phanglo e specifikune ERES-esa (Figura 1), amen maj dur investigatisardam te shaj akava proceso te involvirinel vi e funkcia e ER-esko exporto proteinako mehanizmo. GPI-AP kerel buti e specialo COPII sistemosa vash ER exporto, savo si aktivno regulirimo kotar o Ted1′s strukturalno remodeliribe e glikanoske kotoresko kotar o GPI ankro (30, 31). O rekombinanto GPI-glikano si pindžardo katar o transmembrano kargo receptoro p24 komplekso, savo pe peski rig selektivno rekrutil Lst1, savo si jekh specifično izoforma katar o maj baro COPII kargo phanglo subunit Sec24, formirindoj jekh GPI-AP-barvalo COPII Vesikula si trubujipe (31-33). Anda kodo, ame kerdam jekh dujto mutanto savo kombinisardas e delecia kadale jekhutne proteinenqi (o p24 komplekso komponènto Emp24, o GPI-glikano remodelàciaqo enzimo Ted1 thaj o specifiko COPII subunit Lst1) e sec31-1 mutantosqe shtamposa, thaj studirisardam len Si śajpe te formiril pes o Gas1-Gluster GFP (Figura 3). Amen dikhlam kaj ko sec31-1emp24Δ thaj sec31-1ted1Δ, o Gas1-GFP si maj but bi-grupirimo thaj distribuirimo kotar e ER membrana, sar so dikhlam maj anglal ko sec31-1 GhLag1, a ko sec31-1lst1Δ, Gas1-GFP Sar sec31-111. Kadala rezultatura sikaven kaj po drom te ovel C26 ceramide ki ER membrana, o grupiribe e Gas1-GFP trubul vi te phandel pes e p24 kompleksosa, thaj na trubul specifično Lst1 rekrutiribe. Palal, ame xramosardam i śajmata kaj i lungina e lancoski e ceramideski anθ-i ER membrana śaj te regulisarel o phanglipe e Gas1-GFP-esqo k-o p24. Numaj, arakhlam kaj i prezenca e C18-C16 ceramideski ki membrana na afektil e GPI-glikanura rekonstruirime katar o p24 komplekso (Figura S3 thaj S4, A thaj B) vaj phanglipe e GPI-AP-esa thaj eksportirime GPI-AP. śajnipen. Rekrutisaren o COPII subtip Lst1 (Figura S4C). Anda kodo, o C26 ceramide-dependent clustering na mangel proteinenge interakcie e diferentne ER exportoske proteinenge mehanizmurenca, numaj suportil jekh alternativno mehanizmo e sortiribasko kerdo katar e lipidno lungipe. Palal, ame analizisardam te si o lungipe e ceramide acyl lancosko ande ER membrana importanto vash e efektivno klasifikacia e Gas1-GFP sar selektivno ERES. Sar o Gas1 ano GhLag1 shtampo e skurto-lancoske ceramidasa mukhel o ER thaj del andre ki plazma membrana (Figura S5), amen pachas kaj te o sortiripe si kerdo kotar o lungipe e ceramide acyl lancosko, o Gas1 ano GhLag1 shtampo shaj te ovel redirektirimo thaj te nakhel. ERES buti savi si la sa kodola membrane.
(A) I membrana e ćhelurenqi e GhLag1-eski maj but si la maj skurto C18-C16 ceramide, kana o GPI ankro e Gas1-GFP-esqo inke si les sa kodo C26 IPC sar e ćhelura e ćhelurenqe. Opral: analìza e lungipnasqi e acilo lancosqi e ceramidaqi anθ-i membrana e ćhelurenqi e śukar-tipurenqi (Wt) thaj GhLag1p śajutnimatenqi anθ-i spektrometria e masenqi (MS). E data sikaven o procento e totalno ceramidako. O prodùso trin independento eksperimenturenqo. Bar e greśenqi = SD. Duj-rig bi-parno t-test. **** P ＜0.0001. Teleno panelo: MS analiza e acyl lancoski lungina e IPC prezento ano Gas1-GFP (GPI-IPC) GPI ankro ekspirime ano wild-type thaj GhLag1p shtammura. E data reprezentisaren o procento katar o sasto IPC signalo. Prosečno katar pandž independento eksperimentura. Bar e greśenqi = SD. Duj-rig bi-parno t-test. ns, na si importanto. P = 0.9134. (B) E fluorescencijake mikrografura katar sec31-1, sec31-1 GhLag1, sec31-1emp24Δ, sec31-1ted1Δ thaj sec31-1lst1Δ čelalja save sikaven galaktoza-inducirime Gas1-GFP sas inkubirime ko 37°C 30 minutura thaj te keren pes rutine fluorescencija mikroskopia palal 24°C. Parno strelo: ER Gas1-GFP grupa. Putardi strela: O Gas1-GFP bi-grupime si distribuime pe sasti ER membrana, sikavindoj o ER karakteristikano nuklearno ringosko koloripe. Skala, 5μm. (C) Kvantifikàcia e fotomikrografosqi deskriptisardi anθ-o (B). O prosečno procento e čelaljengo saven si punktirime Gas1-GFP struktura. Ano trin independentno eksperimentia, n≥300 čelalja. Bar e greśenqi = SD. Duj-rig bi-parno t-test. **** P ＜0.0001.
Te śaj te laćharas kadava problèmo direkto, kerdăm SCLIM vizualizàcia e Gas1-GFP thaj Mid2-iRFP anθ-o GhLag1 e sec31-1 temperatura-senzitivno mutanto alèlo (Figura 4 thaj Filmo S4). Palal so o ER sas arakhlo k-o 37°C thaj palal kodoja mukhlo k-o 24°C, maj but katar o nevo sintetizime Gas1-GFP na sas ćhivdo ande grupa thaj na sas distribùcia anθ-i sasti ER membrana, sar so sas dikhlino katar e konvencionalne mikroskopura (Figura 4, A thaj B ). Paše odova, baro procento e ERES-esqo (67%) inćarel duj vrjama e kargoske ko-lokalizime ande leste (Figura 4D). E panelura 1 thaj 2 katar e Figura 4C sikaven duj tipicno egzemplura katar ERES save si len Gas1-GFP thaj Mid2-GFP. Paše odova, e duj butja sas rekrutirime ko jekh ERES (Figura 4E, panelo 3 thaj filmo S4). Anda kodo, amare rezultatura sikaven ke o lungipe e ceramide acil lancosko ande ER membrana si jekh importanto determinanto vash e ER proteinaki agregacia thaj klasifikacia.
Sec31-1 GhLag1 ćhelura save sikaven galaktoza-inducirime sekrecie, Gas1-GFP (GPI-AP, zeleno) thaj Mid2-iRFP (TMP, lole) thaj konstitutivno ERES-markirime Sec13-mCherry (ERES, magenta) Inkubirinen ko 37°C. Keren maj dur 30 minutură, ćhiven len źi k-o 24°C te mukhen e sekrecie, thaj keren i imagìna e SCLIM-eça palal 20 minutură. (A ji ko C) Reprezentativno 2D projekciake slike (A; skala bar, 1μm) vaj 3D slike e hemisferake slike (B thaj C; skala jekhin, 0.45μm) kotar e 10 z-sekcije markirime kotar o kargo thaj ERES. O tikno panelo ko (B) thaj o panelo ko (C) sikaven procesirime slike te sikaven numaj e butja save si ko ERES (magenta) [Gas1-GFP (gri) thaj Mid2-iRFP (lokhes lole)]. (C) Parno pherdo strela: ERES, buti pherdo. Puterdi strela: ERES si les numa jekh artiklo. Telal o panelo: O alosardo ERES si les pherdo buti (1 thaj 2) markirime ko (C). Skala bar, 100 nm. (D) Kvantifikàcia e fotomikrografosqi deskriptisardi anθ-o (C). Ano sec31-1 thaj sec31-1 GhLag1 jekhina, numa jekh kargo (Gas1-GFP ja Mid2-iRFP) si andre, thaj o prosečno procento e ERES-esko vash izolirime kargo thaj preklopime kargo. Ano trin independentno eksperimentia, n = 432 ano 54 čelalja (sec31-1) thaj n = 430 ano 47 čelalja (sec31-1 GhLag1). Bar e greśenqi = SD. Duj-rig bi-parno t-test. *** P = 0.0002 (sec31-1) thaj ** P = 0.0031 (sec31-1 GhLag1). (E) 3D-esqo dikhipen e alosarde ERES-esqo e śerutne kargosa (3) markisardo anθ-o (C). Gas1-GFP (zeleno) thaj Mid2-iRFP (lole) paśon e ERES (magenta) katar i sasti rig thaj ačhon anθ-i sasti ERES restrikciaqi rig. Skala bar, 100 nm.
Kadi studia del direktno in vivo evidencia kaj e lipid-bazirime proteinenge kargo si klasifikuime ande selektivno exportoske thana ande sekretorno drom, thaj sikavel e importanca e acyl lancoski lungina vash e klasifikaciaki selektiviteta. Sar hasnisaras jekh zurali thaj avansime mikroskopikani teknika akhardi SCLIM, sikavdam o nevo sintetizirimo Gas1-GFP (jekh baro plazma membranako GPI-AP e but lungo acyl chain (C26) ceramide lipid porcia) ande drozhda) E regionura save si phangle ande diskrete ERs si asociime e specifična EER-enca, kana e transmembrana proteinura si distribuime katar e membrana ERRES (Figura 1). Paše odova, akala duj tipuria e butjake den andre diferentno ERES selektivno (Figura 2). I lungina e acilo lancoski e celulozno ceramidaki ki membrana si tiknjardi katar C26 dži ko C18-C16, o Gas1-GFP klastero si phagerdo ko diskretno ER regiono, thaj o Gas1-GFP si rerutirimo te mukhel o ER e transmembransko proteinosa prekal o sasto ERES (Figura 3 thaj Figura 3). 4).
Vi te o GPI-AP kerel buti e specializirime proteinencar te ikljol kotar o ER, arakhlam kaj i C26 ceramide-dependent separacia na dependil pe diferentno proteinenge interakcie save shaj te anen ERES specializacia (Figure S4 thaj S5). Ande thana, amare arakhadipa suportin jekh alternativno klasifikaciako mehanizmo kerdo katar o lipid-bazirime proteinengo grupipe thaj palal kodo ekskluzia katar aver kargo. Amare obzervàcie sikaven kaj o Gas1-GFP regiono vaj o klastèro asociime jekhe specifikone ERES-eça na si les o transmembrano sekretime proteino Mid2-iRFP, so sikavel ke o C26 ceramide-dependent GPI-AP klastèro ka źutil len te aven andre anθ-o relevanto ERES, thaj anθ-o sa kodo vaxt, ka nakhen o transmembrano. Ande kontrasta, i prezenca e C18-C16 ceramidenqi anθ-i ER membrana na kerel e GPI-AP te kerel regionură vaj grupe, kadja von na ekskludin vaj na paruven e transmembranqe sekretime proteinură anθ-o sa kodo ERES (Figure 3 thaj 4). . Anda kodo, ame propozisaras ke o C26 ceramide kerel separacia thaj klasifikacia kana kerel maj lokho o grupipe e proteinengo phangle e specifikune ERES-esa.
Sar te resel pes akava C26 ceramide-dependantno grupipe ano specifiko ER than? I tendenca e membranake ceramideski te ulaven pes lateralno śaj te kerel e GPI-AP thaj e C26 ceramide te keren tikne thaj instantno òrdine lipidura anθ-o maj na-regularno lipidno ambiènto e ER membranaqo savo si les maj skurto thaj na-saturime glicerolipidura. Kvalitetno grupe (17, 18). Kadala cikne temporarno grupe śaj te aven maj dur fuzime ande maj bare, maj stabilne grupe palal o phanglipe e p24 kompleksosa (34). Konzistentno kadalesa, sikavdam kaj o C26 Gas1-GFP trubul te kerel interakcija e p24 kompleksosa te kerel majbare dikhline grupe (Figura 3). O p24 komplekso si jekh heterozigoto oligomero kerdo katar štar diferentne p24 transmembranikane proteine ​​ande kvas (35), savo del multivalentno phanglipe, savo šaj te kerel cross-linking e cikne GPI-AP grupengo, kadea ke kerel pes maj baro Stabilno grupa (34). I interakcija maškar e proteinenge ektodomeni e GPI-AP-enge šaj te del kontribucia vi lengere agregaciake, sar so si sikavdo kana si len Golgi transporto ande mamiferonge polarizirime epitelialno čelalja (36). Numaj, kana o C18-C16 ceramide si prezento ki ER membrana, kana o p24 komplekso phandel pes e Gas1-GFP, bare averhande grupe na ka oven kerdine. O fundono mehanizmo śaj te avel phanglo e specifikane fizikane thaj kemikane proporcienqe e lungone acilo lancoske ceramide. Biofizikane studie pe artificialne membrane sikaven kaj vi te si ke vi lunge (C24) thaj vi skurto (C18-C16) acil lancoske ceramide shaj te keren fazaki separacia, numaj lunge acil lancoske ceramide (C24) shaj te promovirinen bari kurvatura thaj filmosko kovlipe te shaj te kerel pes o filmo. Prekal jekh avresqi referènca (17, 37, 38). Si sikavdo kaj o transmembransko helix e TMED2, o manušikano homologo e Emp24, selektivno kerel interakcija e C18 ceramide-bazirime sfingomielina ande citoplazmatikane lobule (39). Sar hasnisaras e simulacie e molekulare dinamikake (MD), arakhlam kaj e C18 thaj e C26 ceramide akumulirinen pes krujal e citoplazmatikane lobule e Emp24 transmembransko heliksoske, thaj si len similarno preferencie (Figura S6). Si te ovel ramosardo kaj akava sikavel kaj o transmembrano helix e Emp24 shaj te kerol asimetrikani distribùcia e lipidenqi ki membrana. Akava si nevo rezultato bazirimo pe mamalengere čelalja. Similarno MD simulàcie sikaven vi i prezènca e eter lipidenqi (40) . Anda kodo, ame spekulisaras ke o C26 ceramide ande duj lobule katar o ER26 si lokalno barvalo. Kana o GPI-AP ande luminalne lobule direktno phandel pes e multivalentno p24 thaj e akumulàcia e C26 ceramideski paśal o p24 ande citoplazmatikane lobule, śaj te promoviril e agregacia e proteinenqi thaj e membranaqi kurvatura savi si laćhi savi si kerdini katar e deśa (41), so kerel o GPI-AP te ulavel pes anθ-e diskrète regionură paśal e ERES regionură, save vi von si favorizirime e regionurenqe bare i ER membrana (42). E anglune raportura suportisarde o propozalo mehanizmo (43, 44). O multivalentno phanglipe e oligolektinenqo, e patogenenqo vaj e antitelaqo karing e glikosfingolipidura (GSL) bazirime pe ceramida anθ-i plazmaqi membrana kerel bari agregacia e GSL-esqi, vazdel i separacia e fazaqi thaj kerel i deformàcia thaj i internalizàcia e membranaqi (44). Iwabuchi etc. (43) Sas arakhlo kaj ano than e lunge (C24) numa na skurto (C16) acil lancura, o multivalentno ligando phanglo e GSL laktozilceramidesa inducirinela o formiribe bare grupengo thaj membranaki invaginacia, thaj e citoplazma Lyn-mediaciaki signaloski transdukcia pe lila si interditirimi kotar neutrofilno lancura ande parne.
Ande polarizirime epiteliàlo ćhelură le mamalenqe, i koncentràcia le anti-Golgi netvorkoski (TGN) źi k-o nivèlo le apikàlo plazmaqe membranàqo kontrolisarel i separacia thaj o śerutno GPI-AP (10, 45). Kadi agregacia si kerdini katar e GPI-AP oligomerizacia (36), numaj śaj vi te avel phanglo e ceramide lancoske lungimasa so arakhas ande kvas. Vi te si o GPI-AP e mamalenqo si les jekh ankro bazirime pe eter lipid, thaj lesqi ximikani struktura si but aver katar o but lungo acil lanco ceramide, jekh nevi studia arakhlja kaj e duj lipidura si len evoluciaqe sa kadja fizikane thaj ximikane proporcie thaj funkcia (40). Anda kodo, o eter lipidno kotor ande mamiferonge čelalja šaj te avel sar o C26 ceramide ande kvas, thaj lesko rolo si te asociil pes e lungo-lanco ceramide ande membrana te promovirinel e GPI-AP agregacia thaj sortiripe. Vi te kadaja śajmata trubul te avel testime direkto, e anglune arakhadimata den suporto kaj o transporto e lungo acilno lancoske ceramide ko Golgi trupo na kerel pes katar e citoplazmatikane transferoske proteine, numaj dependil katar e sinteza e GPI ankrengi sar so si o kvas. Anda kodo, o evoluciaqo konservativo mekanìzmo dikhel pes te avel śajdo te ko-transportisarel selektivno but lungo acil lanco ceramide thaj GPI-AP (13, 16, 20, 46, 47) anθ-i sasti transportosqi vesikula.
Ano sistemo e epitelikane ćhelurenqo polarizirime e ćhelurenqo thaj e mamalenqo, i agregacia e GPI-AP-esqi thaj i separacia katar aver proteine ​​e plazmaqe membranenqe sa keren pes anglal te aresen i ćhelurenqi rig. Paladino thaj aver. (48) arakhlja kaj pe TGN e mamiferengo polarizirime epitelialno čelalja, o GPI-AP grupiribe na numaj si trubujipe vash e selektivno klasifikacia e GPI-AP-enge ki apikalno plazma membrana, numaj vi regulirinel e grupiribaski organizacia e GPI-AP-enge thaj Lesko biologikano aktiviteto. Surfaca e celulozaki. Ano kvas, akava rodipe sikavda kaj o C26 ceramide-dependantno GPI-AP grupa ko ER shaj te regulirinel e grupako organiziribe thaj funkcionalno aktiviteto e GPI-AP pe plazma membrana (24, 49). Konzistentno kadale modelosa, e GhLag1 čelalja si alergikane karing e GPI inhibitora vaj e droge save keren efekto pe integriteto e čelalenge (28), thaj o trubujipe pala funkcionalno Gas1-GFP grupe (49) katar o tip ceramide projektirime ando phanglipe e čelalenge e droždengo sikavel G� Posibilno fiziološke konsekvence katar e hLag1 čelalja. GPI-AP xatăripen. Numaj, maj dur te kerel pes testura te si ke i funkcionalo organizàcia e ćhelurenqi sas programisardi katar o ER katar jekh metoda e śerutnimaski bazirime pe lipidno lungipen ka ovel o subjèkto amare avutne rodipnasko.
E Saccharomyces cerevisiae śajutne save si hasnime anθ-i kadaja buti si xramosarde anθ-i Tèbla S1. E MMY1583 thaj MMY1635 shtammura katar o SCLIM vash e źivde ćhelura sas kerde ando fundo katar o W303. Kadala shtammura save sikaven Sec13-mCherry e fluorescentno proteinako tag sas kerdine kotar e metoda bazirime pe polimerazaki lancoski reakcia (PCR) e pFA6a plazmidosa sar šablono (23). O shtampo savo sikavel Mid2-iRFP markirime e fluorescentno proteinasa telal o kontrolo e GAL1 promotoresko sas kerdo sar so si. PCR amplifikàcia e iRFP-KanMx sekvencaqi katar o pKTiRFP-KAN vektòro (daro katar o E. O'Shea, Addgene plazmidosqo gin 64687; http://n2t.net/addgene: 64687; identifikàtoro e resursenqo pal-o rodipen (RRID): Addgene_64687) Thaj thodino anθ-o C-termino endogenous 22. Palal so i Mid2-iRFP genomosqi sekvenca sas amplifikuime thaj klonime anθ-o GAL1 promotòro, sas integrime anθ-o Not I-Sac I than e integraciaqo plazmido pRS306. O rezultato e plazmidosqo pRGS7 sas linearizime e Pst I-aça te integrisarel pes anθ-o URA3 lokuso.
O Gas1-GFP fuzijako gene si ekspirime telal o kontrolo e GAL1 promotoresko ano centromere (CEN) plazmido, savo si kerdo sar so si. I sekvenca Gas1-GFP sas amplificirime katar o PCR katar o pRS416-GAS1-GFP plazmido (24) (dar katar o L. Popolo) thaj klonime ando Xma I–Xho I than katar o CEN plazmido pBEVY-GL LEU2 (dar katar o C) . Miller; Addgene plazmid numero 51225; http://n2t.net/addgene: 51225; RRID: Addgene_51225). O plazmido savo resljarda sas akhardo pRGS6. O Axl2-GFP fuzijako gene si vi ekspirime telal o kontrolo e GAL1 promotoresko e pBEVY-GL LEU2 vektoresko, thaj lesko kerdo si sar so si. I Axl2-GFP sekvenca sas amplificirime katar o pRS304-p2HSE-Axl2-GFP plazmido (23) katar o PCR, thaj klonime ko Bam HI-Pst I than katar o pBEVY-GL LEU2 vektor. O plazmido savo resljarda sas akhardo pRGS12. I sekvenca e oligonukleotidurenqi utilizirime anθ-i kadaja studia si xramosardi anθ-i Tèbla S2.
O shtampo sas pherdo 0.2% adenin thaj 2% glukoza [YP-dextrose (YPD)], 2% raffinoza [YP-raffinoza] barvalo proteino p (YP) mediumo (1 % Yeast extract thaj 2% protein ept). (YPR)] vaj 2% galaktoza [YP-galaktoza (YPG)] sar jekh źanglipe e karbonosqo, vaj anθ-o jekh sintetikano minimalo maśkar (0,15% baza e azotosqi e droźdenqi thaj 0,5% sulfato e amoniaqo) te śaj te pherel pes e adekvatne aminoacìde thaj baze save si trubujipe vaś i nutricia, thaj te avel les 2% glukoza (2% glukoza) vaj minimalo maśkar galaktoza (sintetikano galaktoza minimalno maśkar) sar jekh źanglipe e karbonosqo.
Palal o realo-vràmaqo dikhipen, e temperaturaqe-sensitivne sec31-1 mutantne ćhelură save sikaven o konstrukto telal o GAL1 promotoro sas barjarde anθ-o YPR-esqo maśkar anθ-o 24°C anθ-i raći źi k-i maśkar-log faza. Palal i indukcia anθ-o YPG anθ-o 24°C vaś 1 òra, e ćhelură sas inkubisarde anθ-o SG anθ-o 37°C anθ-e 30 minutură, thaj palal kodoja sas transferime anθ-o 24°C te mukhen pes anθar o bloko e sekreciaqo. O Concanavalin A sas kerdo te laćharel e ćhelura pe jekh staklo thaj sas kerdo katar o SCLIM. SCLIM si jekh kombinàcia e Olympus IX-71 mikroskoposqi inverzime fluorescènca thaj UPlanSApo 100×1.4 numerikano aperturàqo uljesko lenso (Olympus), baro-śukar thaj baro-signàlo-ko-śuźo raporto rotaciaqo disko konfokalno skaneri (Yokogawa Electric), personalizirime spektrometro, personalizirime sistemo vaś intenzìvo e imaźenqo (Hamamatsu Photonics) śaj te del jekh sistemo e śukar lensenqo e agorutne barjaripnaça ×266.7 thaj jekh kamera e aparaturaqi phangli e ćarźasa savi butǎrel e elektronură (Hamamatsu Photonics) (21). O arakhipnasqo lil si kerdo katar o softèro (Yokogawa Electric). Palal 3D-esqe imaźură, ame hasnisaras jekh piezoelektrikano aktuàtoro kerdo palal o mangipen te vibrisarel o objektivo lensa vertikalno, thaj kidas e optikane kotora 100 nm jekh avresθar anθ-jekh ćàso. O Z-stack image si konvertirimo ko 3D voxel data, thaj i teorikani funkcia e punktoski spread savi si kerdini vash o rotaciako disk konfokalno mikroskopo si kerdini vash o dekonvoluciako procesiripe kotar o Volocity softver (PerkinElmer). Ko utiliziribe e Volocity softveresko te kerel pes automatikane prago vash e ko-lokaciaki analiza, ERES inkluzivno o kargo sas merimo. I analìza e linieqi sas kerdini anθ-o softwèro MetaMorph (Molecular Devices).
Keren buti e GraphPad Prism softveresa te dikhen o statistikano signifikànto. Palal o duj-rigărdo Studentosqo t-test thaj o ordinarno jekh-rigăqo analìzo e varìancaqo (ANOVA) testò, e diferencie maśkar e grupe si konsiderime te avel len jekh signifikantno impakto p-o P <0.05 (*).
Palal e fluorescencaki mikroskopia e Gas1-GFP, e log fazake ćhelura sas barjarde sa e raćasa ande YPD thaj sas kidine katar e centrifugacia, thodine duvar e fosfato buferime salinesa, thaj inkubirime pe glazura maj cerra 15 minutura, thaj palal kodoja sas kerde telal o mikroskopo sar sas maj anglal deskriptirime Check (24). O Leica DMi8 mikroskopo (HCX PL APO 1003/1.40 oil PH3 CS) ekipirime e objektivone lensasa, L5 (GFP) filtrosa, Hamamatsu kamerasa thaj Application Suite X (LAS X) softveresa sas kerdo vash o akvizitcia. .
E mostre sas denaturime e SDS probako buferosa ko 65°C 10 minutia, thaj palo odova separime kotar e SDS-poliakrilamidno gel elektroforeza (PAGE). Palal i imunoblotting analìza, 10 μl e mostresqo sas thodino anθ-jekh rig. Primarno antikorpo: Utilizisar o poliklonalno anti-Gas1 e ćororesqo anθ-i jekh dilucia 1:3000, o anti-Emp24 e ćororesqo anθ-i jekh dilucia 1:500, thaj o anti-GFP e ćororesqo poliklonalno (jekh daro katar o H. Riezman) anθ-i jekh dilucia 1:3000. O anti-Pgk1 antikorpo monoklonalno e ćororesko sas kerdo ano jekh dilucia 1:5000 (jekh daro katar o J. de la Cruz). Sekundarno antikorpo: Horseradish peroxidase (HRP) konjugirime bakreski anti-rabbit immunoglobulin G (IgG) kerdo ano dilucia 1:3000 (Pierce). HRP-konjugirime bakro anti-muš IgG sas kerdo ano dilucia 1:3000 (Pierce). I zona e imunitetosqi sas dikhlini katar i metoda e chemiluminescencaqi e SuperSignal West Pico reagentosqi (Thermo Fisher Scientific).
Sar si deskriptirime ko (31), kerdo sas kerdo jekh naturalno imunoprecipitaciako eksperimento pe barvali ER frakcia. Ko skurto, thoven e ćhelura e ćororeske e TNE buferosa [50 mM tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride thaj protease inhibitor mikstura) ko 600 nm ( OD600) ko 100 optikano densiteto duvar. Sas phagerdo e stakloske perlença, thaj palal kodoja e ćhelurenqe ćorre thaj e stakloske perle sas ćhivde avri katar i centrifugàcia. O supernatanto sas palo odova centrifugirimo ko 17,000 g 15 minutia ko 4°C. O peleto sas resuspendime ando TNE thaj o digitalis saponin sas thodino ki jekh agorutni koncentracia 1%. I suspenzia sas inkubirime 1 ćàso rotaciaça k-o 4°C, thaj palal kodoja e na-xramosarde komponente sas line avri centrifugàciaça k-o 13,000 g k-o 4°C 60 minutură. Palal i Gas1-GFP imunoprecipitacia, anglal te inkubisarel pes o egzàmplo e ćorre agarozàqe perlença (ChromoTek) k-i 4°C vaś 1 òra, thaj palal kodoja te inkubisarel pes e GFP-Trap_A (ChromoTek) k-o 4°C vaś 3 òra. E imunoprecipitime perle sas thodine pandž drom e TNE-esa savo sas les 0.2% digoxigenin, eluirime e SDS-esko buferosa, ulade pe SDS-PAGE, thaj analizime katar imunoblotting.
Sar si deskriptirime ko (31), o phanglipe e cross-linking-esko sas kerdo pe barvali ER frakcia. Skurto, i barvali ER frakcia sas inkubirime 0.5 mM dithiobis(succinimidyl propionate) (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA; 20°C, 20 min). I reakcia e phanglimaski sas phangli kana thode glicina (50 mM agorutni koncentràcia, 5 minutură, 20°C).
Sar sas maj anglal deskripto (50), sas kerdini MS analiza e ceramideski ande wild-type thaj GhLag1 shtammura. Ko skurto, e ćhelura sas barjarde źi ko eksponencialo faza (3 źi ka 4 OD600 jekhimata/ml) an-o YPD ko 30°C, thaj 25×107 ćhelura sas kidine. Lengo metabolizmo si phabardo e trikloroacetikane acidosa. Keren buti e ekstrakciake solventosa [etanol, pani, eter, piridin thaj 4.2 N amonium hidroksido (15:15:5:1:0.018 v/v)] thaj 1.2 nmol andruno standardo C17 ceramide (860517, Avanti polar lipid) kvaliteto). Ker buti e monometilamin reagensosa [metanol, pani, n-butanol thaj metilamin solucia (4:3:1:5 v/v)] te keres tikno alkalino hidroliza e ekstraktosqi, thaj palal kodoja hasnis n-butanol saturime e pajesa te ćhives o sol. Po agor, o ekstrakto sas resuspendime anθ-o jekh solvento pozitìvo modo [kloroformo/metanol/pani (2:7:1) + 5 mM amonium acetato] thaj injektime anθ-o spektròmetro e masesqo. O monitorisaripe e bute reakcienqo (MRM) sas kerdo vaś i identifikàcia thaj i kvantifikacia e sfingolipidne molekulenqi. O TSQ Vantage tertiary quadrupole mass spectrometer (Thermo Fisher Scientific) si ekipirimo e robotikane nanoflow ion źanglimasa Nanomate HD (Advion Biosciences, Ithaca, NY) vaś e lipidno analìza. I energia e maripnaski si optimizirimi vaś savi godi kategoria e ceramidaqi. MS data sas line ano pozitivno modo. Vaś svako biologikano replika, o lipidno signàlo si i mediana vaś trin independento meśimata.
Sar si deskriptirime ko (31), e seli (800×107) save sikaven Gas1-GFP sas thodine naturalno imunoprecipitaciake. O purifikuime Gas1-GFP sas ulado katar o SDS-PAGE thaj sas transferime ki poliviniliden fluoride (PVDF) membrana. O proteino sas vizualizirime kana sas pherdo PVDF e amidasa kalo. O Gas1-GFP band sas ćhindlo katar o PVDF thaj thovdo 5 drom e metanolosa thaj jekhvar e likvidno kromatografija-MS (LC-MS) pajesa. Kana inkubisarel pes i membranaqi stripa 500μl 0.3 M NaOAc (pH 4.0), bufèro thaj 500μl nevo xasardo 1 M natrium nitrito mikstura k-o 37°C vaś 3 òre, i lipidno frakcia si mukhli katar o Gas1-GFP thaj si lizisardi. (51). Palal kodoja, i membranaqi stripa sas thovdi śtarvar e LC-MS-esqe pajesa, sušime anθ-i temperatura e sobake, thaj sas garavdi anθ-i atmosfera e azotosqi anθ-i -80°C źi k-i analìza. Sar kontrola, jekh ćorri proba e PVDF membranaqi sas kerdini vaś svako eksperimento. O lipid savo si lino katar o Gas1-GFP sas palal kodoja analizime katar o MS sar si deskripto (50). Ko skurto, PVDF stripe save si len GPI-lipid sas resuspendime ande 75μl negativno solvento [kloroformo/metanol (1:2) + 5 mM amonium acetato] thaj nakhle elektrospray ionizacia (ESI)-MRM/MS Analiza e sfingolipidno speciengo (TSQ Vantage). Ano akava lil, MS data sine objavjimo ano negativno ionsko modo.
Sar so sas phendo maj anglal, o lipidno kotor e GPI ankrosko sas ulado katar o [3H]-inositol-markirime GPI-AP (16). E lipidura sas ulade katar e kromatografia e tikne rigate kotar o sistemo e solventosko (55:45:10 kloroformo-metanol-0.25% KCl) thaj vizualizirime kotar o FLA-7000 (Fujifilm).
E ćhelura save sikaven Gas1-GFP (600×107) sas thodine duvar e TNE buferosa e TNE buferosa, thaj phagerde e stakloske perlenca, thaj palal kodoja sas centrifugime te len pes e ćhelura thaj e stakloske perle. O supernatanto sas palo odova centrifugirime ko 17,000 g vash 1 chaso ko 4°C. O peleto sas thovdo ano TNE thaj inkubirime 1 U PI-PLC (Invitrogen) ano TNE kote so sine 0.2% digitalis saponin 1 chaso ano 37°C. Palal o tretmano e enzimosqo, i membrana sas ćhudini katar i centrifugàcia 17,000 g k-i 4°C vaś 1 òra. Te imunoprecipitisarel pes o Gas1-GFP, o supernatanto sas inkubirime e GFP-Trap_A (ChromoTek) ko 4°C sasti ratyi. O purifikuime Gas1-GFP ulavdo katar SDS-PAGE sas rangjardo e Coomassie briljanto lolesa. O Gas1-GFP koloriribasko band sas ćhindlo katar o ćororo so si krujal o akvedukto, thaj palal i alkilacia e iodoacetamidasa thaj i redukcia e dithiothreitol-esa, sas kerdini i in-gel digestia e tripsinasa. Xramosar thaj sušil e triptikane peptidura thaj e peptidura e GPI-glikanencar. O suxo peptido sas ćhivdo anθ-e 20 μl pani. Injektisaren jekh kotor (8μl) an-o LC. Jekh octadecylsilane (ODS) kolona (Develosil 300ODS-HG-5; andruno diametro 150 mm×1.0 mm; Nomura Chemical, Aichi Prefecture, Japan) sas kerdini te ulavel pes e peptidura ande specifikane gradientoske kondicie. I mobilno faza si o solvento A (0.08% formic acid) thaj o solvento B (0.15% formic acid ano 80% acetonitrilo). Jekh Accela HPLC sistemo (Thermo Fisher Scientific, Boston, Massachusetts) sas kerdo te eluil pes i kolona e solventosa A and-e 55 minutură anθ-o jekh ćorripen 50 μl min-1 anθ-e 5 minutură, thaj palal kodoja i koncentràcia e solventosqi B sas vazdini źi k-o 40%. , Amerikake Thema). O eluàto sas introducime sajekh anθ-o ESI ion źanglipe, thaj e triptikane peptidură thaj e peptidură e GPI-glikanurenca sas analizime katar o LTQ Orbitrap XL (hybrid linear ion trap-orbitrap mass spectrometer; Thermo Fisher Scientific). Ano MS setup, o voltažo e kapilarno źanglimasko sas thodino ko 4.5 kV, thaj i temperatura e transferoske kapilareski sas inkerdi ko 300°C. O kapilarno tenzija thaj o tenzija e lensoski e tuburenqi sas thodine pe 15 V thaj 50 V, respektivno. E MS data sas line ano pozitivno ionosko modo (rezolucia 60,000; masaki ćaćutnipen 10 kotora pe miliono) ano masako rango 300/m/z masako/charge raporto (m/z) 3000. E MS/MS data sas line prekal o ion trap ano LTQ Orbit [XL XL, anglune data save si phangle e cifrenca disociacia kerdini katar o maripe (CID)].
E MD simulacie sas kerde kotar o GROMACS (52) softver thaj MARTINI 2 force field (53-55). O CHARMM GUI Membrane Builder (56, 57) sas palal kodoja kerdo te kerel jekh dujto rig savi si la dioleoylphosphatidylcholine (DOPC) thaj Cer C18 vaj DOPC thaj Cer C26. I topologia thaj e koordinàte e Cer C26-esqe si line katar o DXCE kana si len avri e ekstra perle katar o śero e sfingozinosqo. Ker buti e procesosa savo si deskripto telal te balansiris o dujto strato thaj te keres les, palal kodoja hasnisar e palune koordinàte e sistemosqe te keres jekh sistemo savo si les Emp24. O transmembrano domeni e droždengo Emp24 (reziduura 173 dži ko 193) sas kerdo sar α-helix kotar o vizualno MD (VMD) instrumento molekularno struktura (58). Palal, palal o ćhivipen e lipidenqo save si opral, o proteino sas but granulisardo thaj thodino anθ-o dujto rig labǎrindoj o CHARMM GUI. O agorutno sistemo si les 1202 DOPC thaj 302 Cer C26 vaj 1197 DOPC thaj 295 Cer C18 thaj Emp24. Ionizirinen o sistemo ki koncentràcia 0.150M. Štar independentno replikàcie sas kerde vaś duj duj rigărde kompozicie.
O lipidno dujto rig si balansirimo kotar o CHARMM GUI proceso, savo involvirinel te kerel pes minimalizacia thaj palal kodoja te kerel pes balanso 405,000 paśa, kote so e poziciake limitàcie si gradualno redukime thaj eliminime, thaj o vaxt e paśenqo si vazdino katar 0.005 ps źi ka 0.02 ps. Palal o ekvilibràcia, vov kerel 6 μs jekh vràmaqo paso 0.02 ps. Palal o thovipen e Emp24, utilizin o sa kodo CHARMM GUI proceso te ciknjaren thaj te balansirinen o sistemo, thaj palal kodoja te phiren 8 s ande produkcia.
Sa e sistemurenqe, anθ-o proceso e balansosqo, o presipen si kontrolisardo kaθar o barostato Berendsen (59), thaj anθ-o proceso e produkciaqo, o presipen si kontrolisardo kaθar o barostato Parrinello-Rahman (60). Ano sa e thana, o maśkaruni presia si 1 bar thaj si kerdo jekh semi-izotropikano presiako phanglipe. Ano proceso e balansosko thaj e produkciako, jekh termostato (61) e skurto rekalibraciasa si kerdo te phandel e temperatura e proteinenqi, e lipidoski thaj e solventosqi partikulaqi respektivno. Ano sasto operacia, o ciljo e temperaturako si 310K. I interakcija bi-phanglimaski si ginavdi kana kerel pes jekh lista e paruvipnaski labǎrindoj i Verlet-esqi sxema e 0.005 buferesqi tolerànca. O Coulomb termino si ginavdo kotar o reakciako than thaj o 1.1 nm. O Vander Waals termino kerel buti e śemasa e ćhinavipnaski savi si la jekh distanca 1.1 nm, thaj i Verlet-esqi śema si labărdi vaś o potencijalo ćhivipen (62).
Ko utiliziribe e VMD-esko, o agorutno vaxt maškar e DOPC fosfatno perle ja ceramide AM1 perle thaj o proteino si 0.7 nm, thaj o numero e lipidengo save keren interakcija e proteinasa si ginavdo. Palal i formula, xramosar o faktòro e depleciaqo-barvalimosqo (DE) sar anθ-o (63): DE faktoro = (o gin e totalone lipidenqo anθ-o proteino 0,7) anθ-o proteino 0,7 (o gin e Cer anθ-e totalo lipidenqo)
I raportirimi vlàda si objavjimi sar jekh prodùso, thaj e greśke si śtar independento kopie e SE-qe. I statistikani signifikàcia e DE faktoresqi si ginavdi katar o t test [(averageDE-factor-1)/SE]. Keren o ginavipen e P-esqo katar i jekh-rigărdi distribùcia.
O GROMACS instrumento sas kerdo te ginavel pes i 2D lateralno densitàtaqi mapa e sistemosqi savi si la Emp24 anθ-e palune 250 ns e trasaqe. Te śaj te lel pes i mapa e barvalipnasqi/xasaripnaski e ceramidaqi, i mapa e densitàta e Cer-esqi si xramosardi anθ-i summa e mapaqi e Cer-esqi thaj e DOPC-esqi, thaj palal kodoja si xramosardi anθ-i koncentràcia e Cer-esqi anθ-o trupo. I sasti koloroski mapa si kerdini.
Palal maj but materiàlură vaś kadava lil, mangas tumen te dikhen http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1
Kado si jekh putardo akceso artiklo distribùime telal e kondicie le Creative Commons Attribution-Non-Commercial License, savo del śajsaripen te labărel pes, te del pes thaj te kerel pes reprodukcia anθ-e savi-te-avel medium, źi kana o agorutno labăripen na si vaś komercialno laćhipen thaj i premisa si ke i originalo buti si ćaći. Referìnca.
Nota: Amen mangas tumendar numaj te den tumari e-mail adresa, kadja kaj o manuš savo rekomendisaren les ki rig te džanel kaj kamen te dikhen o e-mail thaj kaj na si spam. Amen na ka astaras nisave e-mail adrese.
Akava pućhipen si kerdo te testisarel pes te san vizitanto thaj te arakhel pes o automatikano bićhaldipen e spam-esqo.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Perez -Lingio Serero, Lopez, Wagazhope (Miho Waga), Misako Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
3D baro-rezoluciaqo realo-vràmaqo dikhipen sikavel i importanca e ceramide lancoski lungina vaś o proteinosqo ćhivipen anθ-e selektivne thana e avridipnaske.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Perez -Lingio Serero, Lopez, Wagazhope (Miho Waga), Misako Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
3D baro-rezoluciaqo realo-vràmaqo dikhipen sikavel i importanca e ceramide lancoski lungina vaś o proteinosqo ćhivipen anθ-e selektivne thana e avridipnaske.
©2020 Amerikani Asociàcia vaś o Anglunipe e Scienciaqo. sa le hakaja si garavde. AAAS si partneri e HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef thaj COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.