Akana *Akana adresa: Köln 50931, Njamco, Köln Excellence Cluster Research on Cellular Stress Response in Aging-related Diseases (CECAD).
I neurodegeneracia e mitokondrikane nasvalimaski si konsiderime sar ireverzibilno soske i metabolikani plasticiteta e neuronurenqi si limitirime, numaj o efekto e mitokondrialno disfunkciako pe e ćhelurenqi autonomia e neuronalno metabolizmosqi anθ-o trupo si bi laćhes xatărdo. Kathe, introducisaras o proteomo specifiko e ćhelurenqo e Purkinje neuronurenqo saven si progresivno OXPHOS deficiènca kerdo katar e phagerdi mitokondrialno fuziaqi dinamika. Amen arakhlam kaj e mitokondrialno disfunkcia kerdas baro paruvipe ano fieldo e proteomikako, savo po agor resljarda te ovel sekvencialno aktiviribe e precizno metabolikane programengo anglal o meripe e ćhelurenqo. Bi te aźukerel pes, amen arakhlam i obviousno indukcia e piruvat karboksilazaqi (PCx) thaj aver anti-aging enzimurenqi save suplementisaren e maśkarthemutne kotora e TCA-qe siklǒvipnasqe. I inhibicia e PCx-esqi vazdel o oxidativo streso thaj i neurodegeneracia, so sikavel kaj i ateroskleroza si la jekh protektivo efekto anθ-e neuronură saven naj OXPHOS. I restauracia e mitokondrialno fuzijaki ande terminalno degenerime neuronura pherdo paruvel kadala metabolikane karakteristike, kadea ke na merel e ćhelura. Amare arakhadipa identifikuin maj anglal bipindžarde droma save den resilienca karing e mitokondrialno disfunkcia thaj sikaven kaj e neurodegeneracia šaj te avel pherdo vi ko palune stadiumura e nasvalimaske.
I centralo rola e mitokondrienqi anθ-o arakhipen e neuronàlo enèrgiako metabolìzmosqo si akcentisardi katar e but neurologikane simptomură asociime e manuśkane mitokondriàlo nasvalimatenθar. Maj but katar kadala nasvalimata si kerdine katar e genengi mutacie save regulirinen e mitokondrialno genengi ekspresia (1, 2) vaj genengi destrukcia savi si ande relacia e mitokondrialno dinamikasa, savi indirektno afektil e stabiliteto e mitokondrialno DNA (mtDNA) (3, 4). I buti anθ-e źivdipnaske modelură sikavdăs ke sar respònso k-i mitokondriàlo disfunkcia anθ-e śerutne śerutne, śaj te aven aktivime e konservativne metabolikane droma (5-7), so del importanto informàcia vaś jekh śukar xatjaripen pal-i patogenèza kadale kompleksne nasvalimaski. Ano baro kontrasto, amaro haćaripe e metabolikane paruvipnasko e specifična tipurengo e ćhelurenqo kerdo katar o generalo bi-lačhipen e produkciako e mitokondrialno adenozin trifosfatosko (ATP) e mozgosko si fundamentalno (8), akcentirindoj i trubujipe te identifikuin pes terapevtikane targetura save śaj te aven utilizirime te arakhen pes vaj te arakhen pes e nasvalimata. Te arakhel pes i neurodegeneracia (9). O bi-informaciaqo si o fakto kaj e nervoske ćhelura si butivar konsiderime te avel len but limitirime metabolikani fleksibilìta ande relacia e ćhelurenqe tipurenqe katar e śerutne śerutne (10). Dikhindoj kaj kadala ćhelura khelen jekh centralo rola ande koordinàcia e furnisaripnaski e metaboliturenqi e neuronurenqe te promovirinen i sinaptikani transmisia thaj te den atùnći kana si dukhade thaj nasvalimata, i śajpe te adaptisarel pes o metabolizmo e ćhelurenqo karing e phare kondicie e mozgoske ćhelurenqe si paśe limitirime k-e gliale ćhelura (11-14). Paše odova, i inherentno celulozno heterogeniteta e mozgoske tkivoski buteder čhinavel o studiribe e metabolikane paruvipnasko savo kerel pes ko specifična neuronalno subgrupe. Sar rezultato, but xarno si pindžardo pal-e egzakto celularno thaj metabolikane konsekvence katar e mitokondrialno disfunkcia ande neuronura.
Te śaj te haćaras e metabolikane konsekvence katar e mitokondrialno disfunkcia, ame izolisardam e Purkinje neuronura (PNs) ande diferentne stadiumura katar e neurodegeneracia kerdini katar o xasaripe katar e mitokondrialno avrutni membranaki fuzia (Mfn2). Vi te si e Mfn2 mutacie ande manuša asociime e jekhe formasa e hereditarno motorikane senzorikane neuropatijaki pindžardi sar Charcot-Marie-Tooth tipo 2A (15), e kondicionalno destrukcia e Mfn2 ande čhura si jekh lačhe pindžardi indukcia e oxidaciaki-Fosforilaciaki (OXPHOS) disfunkciaki metoda. E diferentne neuronalne subtipura (16-19) thaj o neurodegenerativno fenotip savo avela si akomodime katar progresivno neurologikane simptomura, sar so si e nasvalimata e phirutne (18, 19) vaj e cerebellarno ataksia (16). Kana hasnisaras jekh kombinàcia e bi-etiketaqi kvantitativno (LFQ) proteòmikaqi, metabolomikaqi, imaging-esqi thaj virologikane metodenqi, sikavas ke i progresìvo neurodegeneracia zurales induciril i piruvat karboksilaza (PCx) thaj aver faktora save si ande arterioskleroza e PN-enqi in vivo I ekspresia e enzimenqi. Te verifikuisaras i relevanca kadale arakhipnaski, amen specifično tele-regulisaras i ekspresia e PCx-esqi anθ-e Mfn2-deficitne PN-ură, thaj arakhlam ke kadaja operacia vazdel o oxidativo streso thaj vazdel i neurodegeneracia, kadja sikavindoj ke i azoospermia del meripe e ćhelurenqo Metabolikano adaptàciaqo. E phare ekspresia e MFN2-eski śaj te arakhel pherdo e terminalno degeneraciaki PN e phare OXPHOS-esqe deficièncaça, baro konsumo e mitokondriàlo DNA-qo, thaj dikhlino phagerdo mitokondriàlo netvorko, so maj dur akcentisarel ke kadaja fòrma e neurodegeneraciaqi śaj te sastiol vi anθ-o maj baro stadiumo e nasvalipnasqo anglal o meripe e ćhelurenqo.
Te śaj te vizualizisaras e mitokondrie anθ-e Mfn2 knockout PNs, amen hasnisaras jekh śuźo ćororo savo del śajsaripen e Cre-dependentne mitokondrienqe te astaren e lole fluorescentno proteina (YFP) (mtYFP) (20) Cre ekspresia thaj kontrolisaras e mitokondriaki morfologia in vivo. Amen arakhlam kaj o xasaripe e Mfn2 genesko ano PNs ka kerol gradualno ulavipe e mitokondrialno netvorkosko (Figura S1A), thaj o maj angluno paruvipe sas arakhlo kana sas 3 kurke. Ko kontrasto, i substancialno degeneracia e PN-esqe ćhelurenqi, sar si sikavdo kotar o xasaripen e Calbindin-esqo imunokoloraciaqo, na astarda źi ko 12 kurke (Figura 1, A thaj B). O na-maladipen e vramako maškar e maj anglune paruvimata ki mitokondriaki morfologia thaj o dikhindo starto e neuronalno meripnasko kerdas amen te rodas e metabolikane paruvimata save si kerdine katar e mitokondriaki disfunkcia anglal o meripe e ćhelurenqo. Amen kerdjam jekh stratègia bazirime pe fluorescenca-aktivime ćhelurenqi sortàcia (FACS) te izolisaras o PN (Figura 1C), thaj anθ-e kontrolne śuśe (Mfn2 + / loxP :: mtYFP loxP- stop-loxP: : L7-cre), maj dur akhardo sar CTRL (Figura S1BRL). I optimizàcia e gating-esqi bazirime p-i relativo intenzitèta e YFP-esqe signàlosqi del amen śajsaripen te purisaras o YFP+ trupo (YFPhigh) e PN-enqo katar e na-PN-ură (YFPneg) (Figura S1B) vaj katar e putativne fluorescentne akson/dendritikane kotora (YFPlow; Figura S1D, ćaćutno), konfirmime katar o konfokalno mikroskop (Figura S1D, ćaćutno). Te śaj te verifikuisaras i identitèta e klasifikuime populaciaqi, kerdăm LFQ proteomics thaj palal kodoja analìza e prinзarde komponentença, thaj arakhlam ke si jekh klaro separacia maśkar e YFPhigh thaj YFPneg ćhelură (Figura S1C). E YFPhigh ćhelura sikade jekh barvalipe e pinʒarde PNs markerenqo (vaś egzàmplo Calb1, Pcp2, Grid2 thaj Itpr3) (21, 22), numaj na sas barvalipe e proteinenqo save si butivar ekspirime anθ-e neuronură vaj anθ-e aver ćhelurenqe tipuria (Figura 1D) ). Jekh komparacia maškar e mostre ande klasificirime YFPhigh čelalja save si kidine ande independentne eksperimentura sikavel jekh korelaciako koeficiento> 0.9, so sikavel lačhi reproducibiliteta maškar e biologikane replike (Figura S1E). Ande summa, kadala date validisarde amaro plano vaś akutno thaj specifiko izolàcia e śajde PN-esqi. Soske o L7-cre sistemo so si kerdo kerel mozaikani rekombinàcia anθ-o angluno kurko palal o bijandipen (23), ame astardăm te mudaras e śuśe katar o CTRL thaj kondicionàlo (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre) Kolektìva neuronură. Palal so i rekombinàcia si kerdini, akharel pes Mfn2cKO kana si 4 kurke. Sar agor, alosardam 8 kurke kana o PN strato sas intakto bizo dikhipe e mitokondrialno fragmentàciaqo (Figura 1B thaj Figura S1A). Sa khetane, amen kvantifikisaras jekh totalo 3013 proteine, katar save karing 22% sas bazirime pe MitoCarta 2.0 anotacie bazirime pe mitokondrialno proteomo sar mitokondrie (Figura 1E) (Figura 1E) (24). I diferenciàlo analìza e genengi ekspresiaqi kerdini anθ-o kurko 8 sikavdăs ke numaj 10,5% anθar sa e proteinură sas len signifikantne paruvimata (Figura 1F thaj Figura S1F), katar save 195 proteinură sas tele-regulisarde thaj 120 proteinură sas opre-regulisarde (Figura 1F). Si te ovel ramosardo kaj i “inovativno dromski analìza” kadale datengo sikavel kaj e diferentno ekspirime gene maj but peren ko jekh limitirime set e specifična metabolikane dromengo (Figura 1G). Interesno, vi te si ke o tiknjaripe e dromengo save si phangle e OXPHOS-esa thaj e kalciumoske signalizaciasa konfirmil e indukcia e mitokondrialno disfunkciaki ande fuzijake-deficitno PN-ura, aver kategorie save maj but involvirinen o aminoacidno metabolizmo si signifikantno opre-regulime, so si ande linia e metabolizmosa savo kerel pes ande mitokondrialno PN-ura Rewiring si konzistento. disfunkcia.
(A) Reprezentàciaqe konfokalne fotografie e cerebellarne kotorenqe e CTRL thaj Mfn2cKO śuśenqe save sikaven progresìvo xasaripen e PN-enqo (calbindin, śukar); le nukleura sas kontrafarbime e DAPI-aça. (B) Kvantifikàcia e (A) (jekh-rig analìza e varìancaqi, ***P<0.001; n = 4 źi ka 6 ćàsurǎ katar trin śuśe). (C) Eksperimentalno butjako drom. (D) Distribucia e toplinaki mapa e markerenqi specifiko vaś o Purkinje (opre) thaj aver ćhelurenqe tipuria (maśkar). (E) Venn diagramo savo sikavel o gin e mitokondrikane proteinenqo identifikuime anθ-o klasifikuime PN. (F) Vulkanosko grafiko e diferentno ekspirime proteinengo ande Mfn2cKO neuronura ko 8 kurke (signifikàciaqo ćàso 1.3). (G) I analìza e kreativitètaqe dromesqi sikavel e panз maj importanto droma vaś o upre-regulàcia (lole) thaj e tele-regulàcia (lole) anθ-o Mfn2cKO PN klasifikuime sar 8 kurke. O nivelo e ekspresiako mashkar sako detektirimo proteino si sikavdo. Grayscale termal mapa: ajutisardo P-value. ns, na si importanto.
E proteomikane date sikade kaj e proteinaki ekspresia e kompleksenqi I, III, thaj IV tiknjarel pes tikno-tikno. E kompleksura I, III, thaj IV sa sas len esencijalno mtDNA-kodirime subunitetura, kana o komplekso II, savo sas numaj nuklearno-kodime, sas bi-afektirime (Figura 2A thaj Figura S2A). . Konzistentno e proteomikane rezultaturenca, i imunohistokemia e sekcienqi e cerebellarne ćhibăqi sikavdăs ke o MTCO1 (mitokondrialno citokromo C oxidaza subunit 1) subunit nivelo e kompleksosqo IV anθ-o PN gradualno tiknărdăs pes (Figura 2B). O mtDNA-kodirime subunit Mtatp8 sas signifikantno redukime (Figura S2A), džikote o nivelo e stabilno-statosko e nuklearno-kodirime ATP sintazako subunitetesko ačhilo bi paruvdo, so si konzistento e pindžarde stabilno ATP sintazake subunitasa F1 komplekso kana e mtDNA ekspresia si stabilno. I formacia si konzistento. Phande (7). Evaluàcia e nivelosqi e mtDNA-qi anθ-e śerutne Mfn2cKO PNs anθ-i reakcia e lancosqi polimerazaqi anθ-o ćaćutno vaxt (qPCR) konfirmisardas o gradualo tiknǎripen anθ-o gin e mtDNA-qe kopienqo. Komparaciasa e kontrolno grupasa, kana sas 8 kurke, numaj karing 20% ​​katar o nivelo e mtDNA sas arakhlo (Figura 2C). Konzistentno kadale rezultaturenca, o konfokalno mikroskopikano koloriripe e Mfn2cKO PNs sas kerdo te arakhel pes o DNA, sikavindoj o konsumo e mitokondrialno nukleotidurenqo phanglo e vramasa (Figura 2D). Amen arakhlam kaj numaj nesave kandidatura save si ande mitokondrialno proteinsko degradàcia thaj stresosko respònso sas upre-regulime, maśkar lende Lonp1, Afg3l2 thaj Clpx, thaj OXPHOS kompleksno asamblejake faktora. Na sas dikhline signifikantno paruvimata ko nivelo e proteinengo save si ande apoptoza (Figura S2B). Sar vi, arakhlam kaj e mitokondrie thaj e endoplazmatikane retikulumeske kanala save si ande relacia e kalciumoske transportosa si len numaj cikne paruvimata (Figura S2C). Paše odova, i evaluàcia e proteinurenqi save si len phanglipe e autofagiaça na arakhlăs signifikantne paruvimata, so si konzistento e dikhipnaça e autofagosomenqi dikhlini in vivo katar i imunohistokemia thaj e elektronosqi mikroskopia (Figura S3). Numaj, i progresivno OXPHOS disfunkcia anθ-e PNs si akomodime katar e śukar ultrastrukturàlo mitokondriàlo paruvimata. E mitokondrikane grupe śaj te dikhen pes anθ-e ćhelurenqe trupura thaj anθ-e dendritikane kaśta e Mfn2cKO PN-enqe save si len 5 thaj 8 kurke, thaj i andruni membranaqi struktura nakhlas bare paruvimata (Figura S4, A thaj B). Konzistentno kadale ultrastrukturàlo paruvipnaça thaj jekh signifikantno tiknǎripen anθ-o mtDNA, i analìza e akutne cerebralne cerebellarne kotorenqi e tetramethylrhodamine metil esterǎça (TMRM) sikavdǎs ke o mitokondriàlo membranàqo potenciàlo anθ-e Mfn2cKO PNs sas signifikantno tiknǎrdo (Figura S4C).
(A) Analìza e vaxtǎqi e nivelosqi e ekspresiaqi e OXPHOS kompleksosqi. Numaj te dikhel pes e proteine ​​saven si P<0.05 ko 8 kurke (duj-drom ANOVA). Punktime: Naj ćhinavipen komparativno e ​​CTRL-eça. (B) Left: Jekh egzàmplo vaś jekh cerebellarno kotor etiketirime e anti-MTCO1 antikorposa (skala bar, 20 μm). O than savo si len e Purkinje-esqe ćhelurenqe trupura si pherdo lolença. Kaśte: Kvantifikacia e MTCO1 nivelurenqi (jekh-rigăripenqi analìza e varìancaqi; n = 7 źi k-e 20 ćhelǎ analizime katar trin śuśe). (C) qPCR analìza e mtDNA kopienqi anθ-o PN alosardo (jekh-rig analìza e varìancaqi; n = 3 źi k-e 7 śuśe). (D) Left: Jekh egzàmplo vaś jekh cerebellarno kotor markisardo jekhe anti-DNA antikorposa (skala bar, 20 μm). O than savo si len e Purkinje-esqe ćhelurenqe trupura si pherdo lolença. Kaśte: Kvantifikacia e mtDNA lezìenqi (jekh-rig analìza e varìancaqi; n = 5 źi ka 9 ćhelǎ katar trin śuśe). (E) Jekh egzàmplo vaś jekh akutno cerebellarno kotor savo sikavel mitoYFP + Purkinje ćhelură (strela) anθ-i jekh registracia e ćhelurenqi e sasti ćhelurenqi. (F) Kvantifikàcia e IV kurvaqi. (G) Reprezentàciaqe registràcie e depolarizàciaqe injekciaqe anθ-e CTRL thaj Mfn2cKO Purkinje ćhelǎ. O angluno drom: O angluno pulso savo kerdas o AP. O fundono drom: Maj bari AP frekvenca. (H) Kvantifikacia e postsinaptikane spontano inputurenqi (sPSPs). O reprezentativo registràciaqo śero thaj lesqo raporto e zoom-esqo si sikavde anθ-o (I). Jekh-rig analiza e varìancaqi analizisardas n = 5 źi ka 20 ćhelǎ katar trin śuśe. E date si sikavde sar maśkar±SEM; *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001. (J) Reprezentàciaqe trasura e spontano AP-esqe xramosarde labǎrindoj o modo e perforàciaqo e patch-esqo. O maj baro drom: Maj bari AP frekvenca. O fundono drom: zumipe e jekhe AP-esko. (K) Kvantifikisaren i prodùso thaj i maj bari AP frekvenca palal (J). Mann-Whitney test; n = 5 ćhelura sas analizime katar śtar śuśe. E date si sikavde sar maśkar±SEM; na importantno.
O OXPHOS-esko nasvalipe sas dikhlino ko 8-kurke phuro Mfn2cKO PN, so sikavel kaj e fiziološko funkcia e neuronenqi si but abnormalno. Anda kodo, ame analizisardam e pasivno elektrikane karakteristike le OXPHOS-deficitno neuronurenqe 4 źi ka 5 kurke thaj 7 źi ka 8 kurke kerindoj registràcie e patch clamp-esqe sa e ćhelurenqe anθ-e akutne cerebellarne kotora (Figura 2E). Bi te aźukerel pes, o maśkarunipen e membranosqo potencijalo thaj o inputno rezistènca e Mfn2cKO neuronurenqi sas sar o kontrolo, vi te sas tikne diferencie maśkar e ćhelura (Tabela 1). Sar vi, ko 4 dži ko 5 kurke, na sine arakhline signifikantno paruvipa ki relacia e struja-voltaža (IV kurva) (Figura 2F). Numaj, ni jekh Mfn2cKO neuronura 7 źi ka 8 kurke phure na nakhle o IV reźimo (hiperpolarizaciaqo paso), so sikavel ke si jekh klaro sensibilitèta karing o hiperpolarizaciaqo potenciàlo anθ-i kadaja palutni faza. Ande kontrasta, ande Mfn2cKO neuronura, e depolarizirime ćorre save keren repetitivno akciaqo potenciàlo (AP) ćorripen si laćhe tolerime, so sikavel ke lenqe ćorripenqe patretură and-o sasto ćorripen na si signifikantno diferentno katar kodola e 8-kurke-phure kontrolne neuronenqe (Tabela 1 thaj Figura 2G). Sar vi, i frekvenca thaj i amplitùda e spontano postsinaptikane ćorrenqi (sPSCs) sas komparabilno e kontrolaqe grupasa, thaj i frekvenca e eventurenqi barjardi katar 4 kurke źi k-e 5 kurke źi ka 7 kurke źi k-e 8 kurke jekhe similarno vazdipenθar (Figura 2, H thaj I). O periodo e sinaptikane barjaripnasko ano PN (25). Similarno rezultatura sas line palal e perforirime PNs patcha. Kadi konfiguracia kerel te na avel kompenzacia e ATP defekturenqi anθ-e ćhelură, sar so śaj te avel anθ-o xramosaripen e ćhelurenqo patch clamp. Ande partikularno, o potenciàlo e membranosqo anθ-o ćhivipen thaj i frekvenca e spontano phabaripnasqi e Mfn2cKO neuronurenqi na sas afektime (Figura 2, J thaj K). Ande summa, kadala rezultatura sikaven kaj e PN-ura saven si len obviousno OXPHOS disfunkcia śaj te keren buti miśto e bare frekvencake ćhinavipnaske patreturenca, so sikavel ke si jekh kompenzaciaqo mehanizmo savo del len śajsaripen te inkren paśe-normalne elektrofiziologikane response.
E date si sikavde sar maśkar ± SEM (jekh-rigăripenqi analìza e varìancaqi, Holm-Sidak-esqo butivar komparaciaqo testò; *P<0.05). O gin e jekhimatenqo si sikavdo anθ-e paranteze.
Amen ćhudam amen te rodas te si varesavi kategoria and-o proteomikano dataseto (Figura 1G) inklistil droma save śaj te keren kontra e bare OXPHOS-esqe deficièncaqe, kadja te mothovas sostar o afektime PN śaj te inkrel paśe-normalo elektrofiziologia (Figura 2, E źi k-o K). . E proteomikani analìza sikavdăs ke le enzimură save si ande katabolizmo le aminoàcidenqo (BCAA) sas signifikantno upre-regulisarde (Figura 3A thaj Figura S5A), thaj o agorutno prodùso acetyl-CoA (CoA) vaj o succinyl CoA śaj te suplementisarel le trikarboksilatură and-o arteriosklerosis Acid (TCA) cycle. Amen arakhlam kaj o sasto BCAA transaminase 1 (BCAT1) thaj BCAT2 duj vazdile. Von katalizirinen o angluno paso katar o BCAA katabolizmo kana keren glutamato katar α-ketoglutarate (26). Sa e subunitètură save keren o komplekso keto acid dehydrogenase (BCKD) e branched chain-esqo si upregulime (o komplekso katalizil i dekarboksilacia savi avel maj palal thaj i ireversibilno e BCAA karbonosqe skeletosqi) (Figura 3A thaj Figura S5A). Numaj, na sas arakhline obviousno paruvimata an-o BCAA korkoro an-o sortirime PN, so śaj te avel kerdo katar o vazdipen e ćhelurenqo astaripe kadale esencijalne aminoàcidosqo vaj katar o labăripen aver źanglimasko (glukoza vaj laktikano acido) te pherel o TCA-esqo ćàso (Figura S5B). Le PNs saven naj OXPHOS sikaven vi maj bari glutaminaki dekompozicia thaj transaminàciaqe aktivitètură kana si len 8 kurke, so śaj te avel sikavdo katar i up-regulacia le mitokondrialne enzimenqi glutaminaza (GLS) thaj glutamina pyruvate transaminaza 2 (GPT2) (Figura 3, A thaj C). Si te ovel ramosardo kaj o up-regulacia e GLS-eski si limitirimi ko splicirime izoforma glutaminaza C (GLS-GAC) (o paruvipe e Mfn2cKO/CTRL-esko si aproksimativno 4.5-var maj baro, P = 0.05), thaj lesko specifično up-regulacia ko kanceroske tkiva šaj te suportirinel e mitokondrialno bioenergija. (27).
(A) I mapa e toplinaki sikavel o paruvipe e proteinengo nivelo vash o specifikuime drom ko 8 kurke. (B) Examplo e cerebellarno kotoresko etiketirime e anti-PCx antikorposa (skala bar, 20 μm). I lole strela sikavel o trupo e Purkinje ćhelurenqo. (C) Analìza e ekspresiaqi e proteinenqi anθ-o vaxt identifikuime sar jekh importanto kandidato vaś i ateroskleroza (but t-test, *FDR <5%; n = 3-5 śuśe). (D) Opral: Jekh shematikano diagramo savo sikavel e diferentne droma te del pes andre o markizirime karbono savo si and-o [1-13C]pyruvate tracer (vaś egzàmplo, prekal PDH vaj trans-arteriàlo drom). Telal: O grafikoni e violinaqo sikavel o procento e jekh-etiketirime karbonosqo (M1) konvertirime anθ-o aspartikano acido, citrikano acido thaj malino acido palal o markisaripe e akutne cerebellarne kotorenqo [1-13C]pyruvate (parno t-test; ** P <0.01). (E) Jekh pherdo vramaqi historiàqi analìza e sikavde dromesqi. Numaj te dikhel pes e proteine ​​saven si P<0.05 ko 8 kurke. Linia ćorri: naj laćhipnasqi vlàda (duj-rigăripenqi analìza e varìancaqi; * P <0.05; *** P <0.001). E data si sikavde sar mean±SEM.
Ande amari analìza, o BCAA katabolizmo areslo jekh anθar e śerutne droma vaś o up-regulàcia. Akava fakto zurales sikavel kaj o ventilaciako volumo savo del andre ko TCA ciklo shaj te paruvel pes ko PN bi OXPHOS. Akava śaj te reprezentisarel jekh bari forma e neuronalno metabolikane rewiring-esqi, savi śaj te avel la jekh direkto impakto p-i neuronalno fiziològia thaj o źivdipen anθ-o vaxt e arakhipnasko e phare OXPHOS disfunkciaqo. Konzistentno kadale hipotezasa, arakhlam kaj o maj baro anti-aterosklerotikano enzimo PCx si up-regulirimo (Mfn2cKO/CTRL paruvel pes aproksimativno 1.5 drom; Figura 3A), so kataliziril i konverzia e piruvatoski ko oxaloacetato (28), savi si pachavdo kaj si ande mozgoski susuta I ekspresia e astrociteski si restriktirime (29, 30). Konzistentno e proteomikane rezultaturenca, e konfokalno mikroskopia sikavda kaj e PCx ekspresia sas specifično thaj signifikantno vazdini ande OXPHOS-deficitno PNs, kana e PCx reaktiviteto sas maj but limitirime ande adjahar Bergmann glialne čelalja e kontrolake (Figura 3B). Te śaj te testisaras funkcionalo i dikhlini upregulacia e PCx-esqi, amen tretisaras e akutne cerebellarne kotora e [1-13C]pyruvate tracer-eça. Kana o piruvato sas oxidime katar e piruvato dehidrogenaza (PDH), lesko izotoposko etiketa xasajlo, numaj si inkorporime ande TCA cikloske maškarthemutne kana o piruvato si metabolizirimo katar e vaskulare reakcie (Figura 3D). Sar suporto amare proteomikane datengo, dikhlam baro gin e markerengo katar akava tracer ano aspartiko acido kotar e Mfn2cKO kotora, džikote o citrikano acido thaj o malikano acido isi len vi von moderatno trendo, čak na sine signifikantno (Figura 3D).
Ano dopamin neuronura e MitoPark ćorrenqe saven si len mitokondrialno disfunkcia kerdini katar e dopamin neuronura save specifično xasaren o mitokondrialno transkripciako faktor A gene (Tfam) (Figura S6B), i PCx ekspresia sas vi signifikantno up-regulime (31), so sikavel kaj o aceton acid arterioskleroza O arakhipe e nasvalimasko si regulirimo kana kerel pes disfunkcia e neuronenqi OXPHOS ando trupo. Si lačhe te ovel ramosardo kaj si arakhlo kaj e unikalune enzime (32-34) save šaj te oven ekspirime ko neuronura save šaj te oven asociirime e arteriosklerozasa si signifikantno upre-regulirime ko PN-a saven naj OXPHOS, sar so si propionyl-CoA karboksilaza (PCC-A), Malonyl-CoA konvertirinel propionyl-CoA mitoconyl-A thaj succic-Acondrial enzimo 3 (ME3), kasko maj baro rolo si te arakhel o piruvato katar o malat (Figura 3, A thaj C) (33, 35). Paše odova, arakhlam jekh signifikantno vazdipe ko Pdk3 enzimo, savo fosforilirinel thaj odolesqe inaktiviril o PDH (36), ʒi kana na sas arakhline paruvimata ko Pdp1 enzimo savo aktivirinel o PDH ja ko PDH enzimosko komplekso korkoro (Figura 3A). Konzistentno, ande Mern2cKO PNs, i fosforilacia e α1 subunit α (PDHE1α) subunit e pyruvate dehydrogenase E1 komponenta katar o PDH komplekso ande Ser293 (pindžardo te inhibiril e enzimaki aktiviteta katar o PDH) sas vazdini ( Figura S6C) (Figura S6C). O piruvato naj les vaskularno akceso.
Po agor, arakhlam kaj o super drom e serinako thaj e glicinako biosintezako, o relaciako mitokondrialno folato (1C) ciklo thaj e prolina biosintezako (Figura 1G thaj Figura S5C) sa si signifikantno up-regulime, palal e raportura, ano proceso e aktivaciako. E riga save si paše si aktivirime katar e mitokondrialno disfunkcia (5-7). Konfokalno analìza savi del suporto kadale proteomikane datenqe sikavdăs ke anθ-o PN bi OXPHOS-esqo xasardo, e cerebellarne kotora 8-kurke phure śuśenqe sas thodine ka-i serine hydroxymethyltransferase 2 (SHMT2), jekh kljućno enzimo anθ-o mitokondrialo folat-ciklo. Signifikantno imuniteto (Figura S5D). Ande 13 CU-glukoza-inkubirime akutne cerebellarne kotora, e metabolikane trasaripnaske eksperimentura maj dur konfirmisarde i up-regulacia e serina thaj prolina biosintezaki, so sikavel ke o flukso e karbonoske izoformengo ande serina thaj prolina vazdas pes (Figura S5E). Sar e reakcie promovirime katar o GLS thaj o GPT2 si responsibilo vaś i sinteza e glutamatosqi katar o glutamina thaj i transaminàcia maśkar o glutamato thaj o α-ketoglutarato, lenqi upregulacia sikavel ke e OXPHOS-deficitne neuronură si len jekh maj baro mangipen vaś o glutamàto, kadava śaj te avel kerdo te arakhel pes i maj bari biosinteza e prolinaqi (Figura S5). Ande kontrasta kadale paruvipnasa, jekh proteomikani analìza e cerebellarne astrocitenqi katar PN-specifiko Mfn2cKO śuśe sikavdăs ke kadala droma (inkluziv sa e antiperoxidaze) na paruvde pes signifikantno anθ-i ekspresia, kadja sikavdăs ke kadaja metabolikani redirekcia si selektivo karing o degradirime PN (Fig. S6, D źi k-o G).
Ande summa, kadala analìze sikade signifikantno diferentne patrènură vaś e temporàlo aktivàcia e specifikane metabolikane dromenqi anθ-e PN. Vi te si ke e abnormalno neuronalno mitokondrialno funkcia śaj te kerel angluni ateroskleroza thaj 1C remodelàcia (Figura 3E thaj Figura S5C), thaj vi prediktibilno paruvimata anθ-i ekspresia e I thaj IV kompleksurenqi, e paruvimata anθ-i sintèza e serine de novo si numaj. OXPHOS disfunkcia (Figura 3E thaj Figura S5C). Kadala arakhadipa definirinen jekh sekvencialno proceso kote so o streso-inducirime mitokondrialno (1C ciklo) thaj citoplazmatikano (serina biosinteza) responso sinergikane e vazdipenasa e aterosklerozako ano TCA ciklo te shaj te kerel pes o neuronalno metabolizmo.
8-kurke phure OXPHOS-deficitno PNs śaj te inkren bari frekvenca e excitàciaqi aktivitèta thaj te nakhen jekh signifikantno metabolikano rekonekcia te kompenzisarel e mitokondriàlo disfunkcia. Akava arakhipnasqo vazdipe vazdel jekh interesànto śajsaripen kaj vi anθ-o kadava momento, kadala ćhelǎ śaj vi te len terapèutikani intervencia te aźukeren vaj te arakhen i neurodegeneràcia. Butpalal. Amen resljam kadi śajmata prekal duj independento intervencie. Ano angluno metodo, amen dizajnisardam jekh Cre-dependantno adeno-asociirime viruso (AAV) vektori te shaj o MFN2 te ovel selektivno ekspirime ano OXPHOS-deficitno PNs in vivo (Figura S7A). O AAV savo kodisarel o MFN2 thaj o fluorescentno reporter gene mCherry (Mfn2-AAV) sas verifikuime ande primarno neuronoske kulture in vitro, so kerdas ke o MFN2 te avel ekspirime ande jekh Cre-dependantno drom thaj arakhlas e mitokondrialno morfologia, kadea ke na kerdas neuromutacia ande Mfn2cKO neuronura ( Figura S7, B, D thaj B). Palal, kerdăm in vivo eksperimentură te śaj te del pes stereotaktikanes 8-kurke phuro Mfn2-AAV k-o cerebellarno kortèkso e Mfn2cKO thaj kontrolaqe śuśenqo, thaj analizisardam 12-kurke phure śuśenqo (Figura 4A). E tretirime Mfn2cKO śuśe mule (Figura 1, A thaj B) (16). E virusoski transdukcia in vivo kerdas selektivno ekspresia e PN-eski ande varesave cerebellarne kruglja (Figura S7, G thaj H). I injekcia e kontrolno AAV-esqi savi sikavel numaj mCherry (Ctrl-AAV) na sas la signifikantno efekto p-o stepeni e neurodegeneraciaqo anθ-e Mfn2cKO źivutre. Ande kontrasta, i analìza e Mfn2cKOs-enqi transducirime e Mfn2-AAV-eça sikavdăs jekh signifikantno protektivo efekto e PN-esqe ćhelurenqo (Figura 4, B thaj C). Ande partikularno, e neuronenqi densitàta dikhel pes te avel paśe na-diferèncime katar e kontrolne źivutre (Figura 4, B thaj C, thaj Figura S7, H thaj I). I ekspresia e MFN1 numaj na e MFN2 si sa kade efektivno te arakhel e neuronalno meripe (Figura 4C thaj Figura S7, C thaj F), so sikavel kaj i ekspresia e ektopikane MFN1 shaj efektivno te pherel o bi-MFN2. Maj dur analiza pe jekh PN nivelo sikavel kaj o Mfn2-AAV buteder spasisardas e ultrastruktura e mitokondrienqi, normalizirisarda e mtDNA nivelura, thaj paruvdas i bari ekspresia e anti-angiogenezake markereski PCx (Figura 4, C źi ka E ). Vizualno inspekcia e spasime Mfn2cKO śuśenqi anθ-o jekh ćàso kana soven sikavdăs ke lenqi postura thaj e motorikane simptomură (movipen S1 źi k-o S3) sas maj laćhe. Sar konkluzia, kadala eksperimentura sikaven kaj o ćhinavipen e MFN2-esqo anθ-e PN-ură save si but bi-laćhe anθ-o OXPHOS si dosta te ćhivel pes palpale o konsumo e mtDNA-qo thaj te kerel pes ateroskleroza, kadja te arakhel pes i degeneràcia e aksonenqi thaj o meripe e neuronàlo in vivo.
(A) Jekh shema savi sikavel o eksperimentalno skedipe vash injekcia e AAV-esko savo kodirinel MFN2 kana o sikado metabolikano drom si aktivirimo. (B) Reprezentativno konfokalno slike katar 12-kurke-phure cerebellarno kotora transducirime ko 8 kurke ko Mfn2cKO ćirikle thaj markirime anti-Calbindin antitela. Ka-o ćaćutno: Skalàcia e aksonosqe fibrenqi. I skala e aksonoski si 450 thaj 75 μm. (C) Left: Kvantifikacia e Purkinje ćhelurenqi densitàta anθ-o AAV transdukciaqo ćàso (AAV+) (jekh-rig analìza e varìancaqi; n = 3 śuśe). Ćaćes: mtDNA fokusoski analìza anθ-o transducime PN anθ-o kurko 12 (bi-parno t-test; n = 6 ćhelǎ katar trin śuśe). * P <0.05; ** P <0.01. (D) Reprezentàcia e transmisiaqe elektronosqe mikrografurenqi e PN-enqi e Mfn2cKO cerebellarne sekcienqi transducirime e sikavde viralne vektorurenqe. I lole maska ​​sikavel o than savo si len e dendrite, thaj o lole punktirime kvadrato sikavel o zoom dino ki rig; n reprezentisarel o nukleo. Skala, 1μm. (E) sikavel jekh egzàmplo vaś o PCx-esqo koloripen anθ-o PN transducime anθ-e 12 kurke. Skala, 20μm. OE, buteder ekspresia; FC, pherdo paruvipe.
Po agor, amen investigatisaras i importanca e peroxidaza-inducirime ćhelurenqi źivdipnaski anθ-e PN-ură save nakhle OXPHOS disfunkcia. Amen kerdam mCherry savo kodisarel AAV-shRNA (skurto hairpin RNA) savo si specifično phanglo e PCx mRNA-sa e ćororesko (AAV-shPCx), thaj injektirisardam o viruso vaj lesko ćororo kontrolo (AAV-scr) ko cerebelo e ćororesko Mfn2cKO. I injekcia sas kerdini an-o śtarto kurko e berśenqo (Figura 5A) te aresel pes jekh efektivo PCx knockdown an-o periodo kana i PCx-esqi ekspresia barjardi (Figura 3C) thaj o PN-esqo śero sas inke intakto (Figura 1A). Si te ovel ramosardo kaj o ćhivipen tele e PCx-esqo (Figura S8A) kerel jekh signifikantno akceleracia e PN-esqi meripnaski, savi si limitirime ko infektisardo ringo (Figura 5, B thaj C). Te śaj te xatǎras o mekanìzmo e metabolikane efekturenqo inducirime katar o PCx up-regulation, ame studirisardam o redox statuso e PN-enqo palal o PCx fiknockdown thaj o AAV-mediaciaqo optikano biosensori Grx1-roGFP2 sas simultàno ekspirime (Figura S8, B źi k-o D) te evaluisaras o glutation O relativo paruvipen e redox peptidosqo potenciàlo (383). Palal, kerdăm duj-fotonenqi fluorescèncaqi mikroskopia (FLIM) anθ-e akutne kotora e mozgosqe 7-kurke phure Mfn2cKO vaj kontrolaqe ćhavorrenqe te arakhas e potenciàlo paruvimata anθ-o citoplazmàtiko redox statuso palal o verifikàcia e FLIM kondicienqi (Figura S8, E źi k-o G). I analìza sikavdăs jekh signifikantno vazdipen anθ-o stàto e oxidàciaqo jekhe Mfn2cKO PNs-esqo bi PCx-esqo ekspresiaqo, so si aver katar e kontrolne neuronură vaj Mfn2cKO PNs save si len numaj shRNA (Figura 5, D thaj E). Kana i PCx-esqi ekspresia sas tele-regulime, o procento e Mfn2cKO PN-enqo savo sikavel jekh but oxidime stàto vazdilo maj but de trin drom (Figura 5E), so sikavel ke i PCx-esqi up-regulàcia inkerdas i redox kapaciteta e degenerime neuronurenqi.
(A) Jekh shema savi sikavel o eksperimentalno skedipe vash injekcia e AAV-esko savo kodirinel shPCx kana o sikavdo metabolikano drom si aktivirimo. (B) Reprezentativno konfokalno fotografie e 8-kurke phurane cerebellarne sekcienqe anθ-e Mfn2cKO śuśe transducime thaj etiketirime e anti-kalcineurin antikorposa anθ-e 4 kurke. Skala, 450μm. (C) Kvantifikàcia e Purkinje-esqe ćhelurenqi densitàta anθ-e AAV-transducime śerutne (jekh-rig analìza e varìancaqi; n = 3 źi k-e 4 śuśe). E date si sikavde sar maśkar±SEM; ***P<0.001. (D) Reprezentàciaqo FLIM-esqo patreto sikavel o śerutno źivdipen e 7-kurke PN-esqo savo sikavel o glutation redox senzori Grx1-roGFP2 anθ-e specifikuime eksperimentàlo kondicie. LUT (look-up table) raporto: intervalo e vramaqo e źivdipasqo (anθ-e pikosekundură). Skala, 25μm. (E) O histogramo sikavel i distribùcia e Grx1-roGFP2 źivdipnaske valutenqi katar (D) (n=158 źi ka 368 ćhelǎ anθ-e duj śuśe anθ-e svako kondicia). O grafiko opral sako histogramo: sikavel o gin e ćhelurenqo saven si len but maj lunge (lole, oksidime) vaj maj tikne (lole, tiknjarde) źivdipnaske valutură, save nakhen 1 SD katar o śerutno źivdipnasko valuto anθ-o CTRL-AAV-scr. (F) O propozime modelo sikavel o protektivo efekto katar o vazdipe e neuronalno PCx-esko.
Sa khetane, e date save das kate sikaven kaj i re-ekspresia e MFN2-eski śaj te arakhel pherdo o avansime PN e bare OXPHOS deficiencasa, bare mtDNA depleciasa, thaj ekstremno abnormalno ista-sar morfologia, kadea ke del jekh kontinuo progreso vi ande avansime nasvalimata. I neurodegeneracia del reverzibilno evidencia pal-o stadiumo anglal o meripe e ćhelurenqo. Akava stepeni e metabolikane fleksibilnostako si maj dur akcentirimo kotar e kapaciteta e neuronenqi te inducirinen ateroskleroza (jekh rewiring e TCA ciklosko), so inhibirinel e PCx ekspresia ko PNs saven naj OXPHOS thaj vazdel o meripe e ćhelurenqo, odolesqe khelel jekh protektivo rola (Figura 5F).
Ano akava rodipe, amen dijam evidencia kaj o atùnćipen e PN-enqo karing i OXPHOS-esqi disfunkcia si te konvergisarel pes gradualno karing i TCA-esqi ateroskleroza anθ-o ćàso e diferenciàlo aktivàciaqo aktivisardo kaθar e metabolikane programură. Amen konfirmisaras i proteomikani analìza bute komplementàro metodença thaj sikavdam kaj kana si len pharo mitokondriàlo disfunkcia, e neuronură si len jekh maj anglal bipinʒardi fòrma e metabolikane elasticitetosqi. Pe amaro čudipe, o sasto proceso e rewiring-esko na trubul te markerel o agorutno metabolikano than savo avel e neurodegeneraciasa gradualno thaj ireverzibilno, numaj amare date sikaven kaj vov šaj te kerel jekh neurono e arakhipnasko vi ko stadiumo anglal o meripe e celulosko Funkcionalno kompenzaciako mehanizmo. Akava arakhipe sikavel kaj e neuronura si len baro stepeni e metabolikane plasticitetosko ano trupo. Akava fakto sikavel kaj o maj paluno reintrodukcia e MFN2 shaj te pherdol e ekspresia e ključne metabolikane markerenqi thaj te arakhel e PN degeneracia. Pe aver rig, vov inhibiril e ateroskleroza thaj akceleririnel e nervura. transseksualno.
Jekh katar e maj fascinànto arakhadimata anθ-o amaro rodipen si ke le PN-ură saven naj len OXPHOS śaj te paruven o metabolizmo le TCA-esqo ćàso kana vazden opre le enzimură save stimulisaren i arterioskleroza. O metabolikano rearanźiripe si jekh ćaćo xarakteristika e kancerosqe ćhelurenqi, varesave save dependin pe glutamina te pheren e TCA-esqe śerutne maśkarthemutne te keren redukciaqe ekvivalentură, save ćhiven o respiraciaqo lanco thaj inkren i produkcia e lipidenqi thaj e nukleotidenqi biosintezaqe prekursorenqi (39 , 40). Jekh nevo rodipe sikavel kaj ko periferikane tkiva save so nakhen OXPHOS disfunkcia, i rekonekcia e glutamina/glutamate metabolizmosko si vi jekh prominentno karakteristika (5, 41), kote so o drom e glutaminako andre źal ko TCA ciklo si phanglo kotar o pharipe e OXPHOS dukhako (41). ). Numaj, naj klaro evidencia pe varesavi similariteta e neuronalno metabolikane plasticitetosqi anθ-o trupo thaj lesqi śajdi relevanca anθ-o kontèksto e nasvalipnasqo. Ano jekh nevo in vitro rodipe, sikavde pes kaj e primarno kortikane neuronura mobilizirinen e glutamatoske thana vash neurotransmisia, odolesqe promovirinen o oxidativno metabolizmo thaj e ateroskleroza ano kondicie e metabolikane stresoske (42). Si te ovel ramosardo kaj telal i farmakologikani inhibicia e TCA ciklusoski enzima suksinato dehidrogenaza, e piruvatoski karboksilacia si paćavdi te inkrel e sinteza e oxaloacetatoski ande kultivirime cerebellarno granule neuronura (34). Numaj, i fiziològikani relevanca kadale mehanizmurenqi karing o śero (kaj si paćavdo ke i ateroskleroza si maj but phangli k-e astrocitură) inke si la importanto fiziològiko signifikàcia (43). Ano akava lil, amare date sikaven kaj e PNs phagerde kotar o OXPHOS ano trupo shaj te oven paruvde ki BCAA degradàcia thaj piruvato karboksilacia, save si e duj bare źanglimata vaś suplementàcia e TCA pool intermediaturenqi. Vi te si propozime o putativo kontribucia e BCAA katabolizmosko ko metabolizmo e neuronalno energiako, po drom e rola e glutamateski thaj GABA vash e neurotransmisia (44), inke naj evidencia vash akala mehanizmura in vivo. Odoleske, si lokho te spekulisarel pes kaj e disfunkcionalno PN-a śaj te kompenzuin automatikane o konsumo e TCA-esqe maśkarthemutnengo ćhivdo katar o proceso e asimilaciaqo vazdindoj i ateroskleroza. Ande partikularno, o upregulàcia e PCx-esqi śaj te avel trubujipe te inkrel pes jekh vazdipen e mangipnasko vaś aspartic acid, so si sugerime anθ-e proliferàciaqe ćhelură saven si mitokondriàlo disfunkcia (45). Numaj, amari metabolomikani analìza na sikavdăs nisave signifikantne paruvimata anθ-o nivelo e aspartikane acidosqo anθ-e Mfn2cKO PNs (Figura S6A), so śaj te sikavel i diferentno metabolikani utilizàcia e aspartikane acidosqi maśkar e proliferàciaqe ćhelură thaj e post-mitotikane neuronură. Vi te o egzakto mehanizmo e PCx-esqo upregulaciaqo anθ-e disfunkcionalne neuronură in vivo ačhel te avel xarakterizirime, sikavdam ke kadava anglal-vaxt respònso khelel jekh importanto ròlo anθ-o arakhipen e redox-esqo stàto e neuronurenqo, so sas sikavdo anθ-e FLIM eksperimentură anθ-e cerebellarne kotora. Ande partikularno, te arakhel pes e PN-en te na keren up-regulacia e PCx-eski śaj te kerel jekh maj oxidime stàto thaj te akcelerisarel o meripe e ćhelurenqo. I aktivàcia e BCAA-qi degradàciaqi thaj i karboksilàcia e piruvatosqi na si droma te karakterizisarel pes e periferikane ćàsurǎ e mitokondriàlo disfunkciaqe (7). Anda kodo, von dikhen pes sar prioritetno karakteristika e OXPHOS-deficitno neuronurenqi, vi te na si ekh karakteristika, savi si importanto vaś e neurodegeneracia. .
I cerebellarno nasvalipe si jekh heterogeno tipo neurodegenerativno nasvalipe savo obično sikavel pes sar ataksia thaj butivar phagel e PN (46). Kadi populacia e neuronenqi si but vulnerabilo karing i mitokondrialno disfunkcia sosqe lenqi selektivo degeneràcia anθ-e śuśe si dosta te reproducisarel but katar e motorikane simptomură save si xarakterizirime e manuśenqe spinocerebellar ataxia (16, 47, 48). Palal e raportură, jekh transgenikano modelo e śuśesqo e mutanto geneça si asociime e manuśenqe spinocerebellar ataksiaça thaj si les mitokondrialno disfunkcia (49, 50), akcentirindoj i importanca te studirinel pes e konsekvence e OXPHOS-esqe deficièncaqe anθ-o PNPH. Anda kodo, si specialo laćho te izolisarel pes thaj te studiril pes kadaja unikalno populacia e neuronenqi. Numaj, dikhindoj kaj e PN si but senzitivno karing o presipe thaj si len jekh tikno kotor katar e sasti populacia e cerebellarno ćhelurenqi, vaś but studie bazirime pe omics, selektivno separacia lendar sar saste ćhelura si inke jekh pharo aspekto. Vi te si pashe naśti te aresel pes absolutno bi-kontaminacia e avere ćhibăqe tipurenqi (maj but e phureder ćhibăqe), amen kombinisaras jekh efektivo paso e disociaciaqo e FACS-eça te ovel amen jekh dosta baro gin e źivdipnaske neuronurenqo vaś i analìza e proteòmikaqi anθ-o śero, thaj te avel amen jekh but baro proteinosqo śerutno (paśe 3000 proteinură) ande relacia e egzistuime datasa e cerebelosqe (15). Te arakhas i źivdipen e saste ćhelurenqi, i metoda savi das kathe del amen śajsaripen na numaj te dikhas e paruvimata anθ-e metabolikane droma anθ-e mitokondrie, numaj vi te dikhas e paruvimata anθ-e lesqe citoplazmàtikane kolegură, so komplementisarel o labăripen e mitokondriàlo membranosqe etiketenqo te barărel o tipo e ćhelurenqo I nevi metoda vaś o gin e mitokondrienqo anθ-e kompleksură (255). I metoda savi deskriptisaras na numaj si phangli e studijasa e Purkinje čelalenge, numaj šaj te avel lokho te avel aplikime pe svako tip e čelalenge te kerel pes buti e metabolikane paruvimatenca ande nasvale mozgo, inkluzivno aver modelura e mitokondrialno disfunkciake.
Po agor, amen identifikisaras jekh terapèutikaqo vaxt anθ-o proceso e metabolikane rearanźisaripnasqo savo śaj te ćhivel pherdo e śerutne semnură vaś o streso e ćhelurenqo thaj te arakhel e neuronàlo degeneràcia. Anda kodo, te haćaras e funkcionalne implikacie katar o rewiring deskriptime kathe śaj te del fundamentalne dikhimata pe śajde tretmanura te arakhel pes e neuronalno źivdipe kana si mitokondrialno disfunkcia. Avutne rodimata save si phangle te dikhen e paruvimata ando energiako metabolizmo ande aver tipuria e mozgoske čelalenge si trubujipe te sikaven pherdo e aplikabiliteto kadale principosko pe aver neurologikane nasvalimata.
MitoPark śuśe sas deskriptuime maj anglal (31). C57BL/6N ćirikle saven si len loxP Mfn2 gene sas deskriptuime maj anglal (18) thaj si ćhivde e L7-Cre ćiriklença (23). O rezultato dujto heterozigotno ćhavo sas palal kodoja ćhivdo e homozigotno Mfn2loxP/Mfn2loxP śuśenca te keren Purkinje-specifiko gene knockouts vaś Mfn2 (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre). Ano jekh kotor e paruvipnasko, o Gt (ROSA26) SorStop-mito-YFP alelo (stop-mtYFP) sas introducirimo prekal aver nakhavipe (20). Sa e animalno procedure sas kerde ande relacia e Evropake, nacionalne thaj institucionalne rigutimata thaj sas aprovirime katar o LandesamtfürNatur katar o Umwelt thaj Verbraucherschutz, North Rhine-Westphalia, Njamco. E buti e źivutrenqi vi źal palal o źutimos katar i Evropaki Federacia vaś e Asociàcie vaś e Laboratorikane Ćhibăqe Sìencie.
Palal o anesteziribe e nasvale džuvljiako cervikalno dislokacia, o embrio e ćororesko si izolirime (E13). O kortèkso sas disektirime anθ-i Hanks-esqi Balansirime Solucia (HBSS) suplementisardi 10 mM Hepes-eça thaj dino anθ-o Dulbecco-esqo Modified Eagle-esqo Mediumo savo sas les papain (20 U/ml) thaj cisteina (1μg/ml). Inkubirinen o ćàso anθ-o DMEM) thaj disociisaren les anθ-i enzimatikani digestia. Ml) ko 37°C 20 minutia, thaj palo odova mekanikane ćhivdo ano DMEM pherdo 10% fetalno bovino serum. E ćhelura sas thodine pe śukar lila pherdo polilizinaça anθ-i jekh densitàta 2×106 anθ-o 6 cm kulturaqo ćàso vaj anθ-i jekh densitàta 0.5×105 ćhelǎ/cm2 vaś i analìza e imàgenqi. Palal 4 ćàsurǎ, o maśkar sas paruvdo anθ-o than bi Neurobasal serumosqo maśkar savo sas les 1% B27 suplementò thaj 0,5 mM GlutaMax. E neuronura sas palal kodoja inkerde pe 37°C thaj 5% CO2 anθ-o sasto eksperimento, thaj sas dine xabe jekhvar anθ-o kurko. Te śaj te kerel pes i rekombinàcia in vitro, 3μl (24-bunàro kulturaqo ćàso) vaj 0.5μl (24-bunàro plato) katar o AAV9 virusosqo vektòro sas utilizirime te tretisarel pes e neuronură anθ-o dujto dives in vitro: AAV9.CMV.PI.eGFP. WPRE.bGH (Addgene, katalogosko numero 105530-AAV9) thaj AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (Addgene, katalogosko numero 105545-AAV9).
O komplementarno DNA e ćororesko Mfn1 thaj Mfn2 (kerdo katar o Addgene plazmido #23212 thaj #23213, respektivno) si markirime e V5 sekvencasa (GKPIPNPLLGLDST) ko C-terminus, thaj si fuzime e mCherry-esa ando fremo prekal e T2A sekvenca. Grx1-roGFP2 si daro katar o Heidelberg TP Dick DFKZ (Deutsches Krebsforschungszentrum). Te paruvel pes i tdTomato kaseta labǎrindoj konvencionalo klonàciaqe metode, i kaseta sas subklonisardi anθ-o pAAV-CAG-FLEX-tdTomato rig (Addgene referèncaqo gin 28306) te kerel pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5, pAAV-CAG-G FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5 thaj pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 vektorura. Jekh similarno strategija sas kerdini te kerel pes o kontrolno vektoro pAAV-CAG-FLEX-mCherry. Te śaj te kerel pes o AAV-shPCx konstrukto, trubul jekh plazmidno AAV vektòro (VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1]), savo si les i sekvenca e DNA-qi savi kodisarel o shRNA savo si les o PCx e ćororesko (5′CTTTCGCTAGCTAGGCTAAGGCTAAGGCTAGACTTAGA 3′) Telal o kontrolo e U6 promotoresko, mCherry si kerdo telal o kontrolo e CMV promotoresko. I produkcia e aźutipnasqe AAV vektorurenqi sas kerdini palal e instrukcie e fabrikantosqe (Cell Biolabs). Ko skurto, utilizin jekh transfero plazmido savo inkrel mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) tranzitorno Transfekcia e 29AV-MFN2-V5-NV5-en mCherry (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) vaj Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2) kodo gene, sar vi kodo AAV1 kapsidno proteino thaj aksesorikano proteino Packaging plasmid plasmid, utilizindos kalcium phosphate metoda. O krudo virusosko supernatanto sas kerdo katar e ciklusura e zamrznuvne-thavutne ande jekh suxo glazura/etanol thaj lizirime čelalja ande fosfatno buferime saline (PBS). O AAV vektoro sas purifikuime katar o diskontinuo jodixanol gradient ultracentrifugacia (24 chasura pe 32,000 rpm thaj 4°C) thaj koncentrime kotar o Amicon ultra-15 centrifugalno filtro. O titro e genomosqo e AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2.9×1013 genomosko kopia (GC)/ml], AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6.1×1012 GC/ml), AAV1-CAG- FLEX sas sar maj anglal deskripto (d) realno vràmaqo meśimos katar o PCR-q -MFN1-V5 (1.9×1013 GC/ml) thaj AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8.9×1012 GC/ml).
E anglune neuronura sas ćhinde ande 1x PBS sar glazura, kerdine ande peletura, thaj palal kodoja sas homogenizirime ande 0.5% Triton X-100 / 0.5% sodium deoxycholate/PBS lysis buffer savo sas les fosfataza thaj proteaza inhibitoro (Roche). I kvantifikàcia e proteinenqi sas kerdini anθ-o labăripen e bicinchoninic acid assay-esqo (Thermo Fisher Scientific). E proteine ​​sas palal kodoja ulade katar SDS-poliakrilamidno gel elektroforeza, thaj palal kodoja sas ćhivdine pe jekh polivinilidenfluoridoski membrana (GE Healthcare). Blokisar e na-specifike thana thaj inkubirinen e primarno antikorposa (dikh i Tabela S1 vaś detalura) anθ-o 5% thud anθ-o TBST (Tris-buferime saline e Tween-eça), e paśa vaś o thovipen thaj e sekundarno antikorposa anθ-o TBST Inkubirin. Inkubirinen e primarno antikorposa sasti ratyi ko +4°C. Palal o thovipen, thov o dujto antitelo 2 chasura ki temperatura e sobake. Palal, inkubindoj o sasto bloto e anti-β-aktin antikorposa, o sasto pherdo sas konfirmime. Detekcia kana paruvel pes ki chemiluminescenca thaj vazdel pes i chemiluminescenca (GE Healthcare).
E neuronura save sas maj anglal thodine pe stakloske kovlimata sas phangle 4% paraformaldehidosa (PFA)/PBS ko specifikuime vaxt ki temperatura e sobake 10 minutia. E coverslips si anglal pherdo 0.1% Triton X-100/PBS 5 minutia ki temperatura e sobake, thaj palo odova ano blokiribasko buferi [3% bovine serum albumin (BSA)/PBS]. Pe dujto dives, le coverslips sas thodine e blokaciake buferosa thaj inkubirime e adekvatno fluoroforosa-konjugirime sekundarno antikorposa 2 chasura ki temperatura e sobake; po agor, e mostre sas thodine but mishto ano PBS e 4′,6-diamidino-2 -Phenylindole (DAPI) si kontrafarbime thaj palo odova fixirime pe mikroskoposko slajdo e Aqua-Poly/Mount.
Le śuśe (murśa thaj źuvlji) sas anestezirime katar intraperitonealno injekcia ketamin (130 mg/kg) thaj xylazine (10 mg/kg) thaj sas dino subkutano karprofen analgetikano (5 mg/kg) , thaj thodine ande jekh stereotaktikano instrumento (Kopf) ekipirime e warm-esa. Sikaven o šero thaj utilizin jekh dentalno bordo te tiknjaren o kotor e cerebellarno korteksosko savo si ko mis kokalo (katar lambda: šero 1.8, lateralno 1, so si ko lobule IV thaj V). Ker buti e špricake ćororeça te keres jekh tikno ćororo anθ-o šero te na phagel pes i vaskulatura telal. Palal kodoja o tikno ćhudino staklo kapilàro si tikno-tikno thodino anθ-o mikro-śukar (katar -1,3 źi k-o -1 anθ-i ventralno rig e dura mater-esqi), thaj 200 źi k-o 300 nl AAV si injektime anθ-o mikro-injektòro (Narishige) e manuàlo śpricença (Narishige) butivar anθ-o tikno presipen anθ-o jekh vaxt 10 źi ka 20 minutură. Palal i infuzia, thov o kapilaro vaś aver 10 minutură te śaj o viruso te ćhivel pes pherdo. Palal so e kapilarura si avri line, i thuli si sutirime mishto te ciknjarel pes i inflamacia e dukhaki thaj te mukhel pes o animalo te sastiol. E źivutre sas tretirime analgetikane (caspofen) but divesa palal i operacia, anθ-i savi vràma sas lenqi fìzìkani kondicia but laćhes monitorisardi thaj palal kodoja sas eutanizirime anθ-o vaxt savo sas phendo. Sa e procedure sas kerde ande relacia e Evropake, nacionalne thaj institucionalne rigutimata thaj sas aprovirime katar o LandesamtfürNatur katar o Umwelt thaj Verbraucherschutz, North Rhine-Westphalia, Njamco.
E źivutre sas anestezirime ketaminosa (100 mg/kg) thaj xylazinasa (10 mg/kg), thaj o ilo sas perfuzirime anglal 0.1 M PBS, thaj palal kodoja 4% PFA anθ-o PBS. O tkivo sas disektirimo thaj fixirimo ko 4% PFA/PBS sasti rat ko 4°C. Jekh vibririmo čhuri (Leica Microsystems GmbH, Vienna, Austria) sas kerdo te kerel sagitalno kotora (50 μm thulo) katar o fixno mozgo ano PBS. Te na si specifikuime aver rig, o koloripe e slobodo-phangle kotorengo sas kerdo sar so si deskriptirime opral (13) ki temperatura e sobake thaj ćhivindoj. Ko skurto, anglal, e resle kotora sas permeabilizirime 0.5% Triton X-100/PBS 15 minutia ki temperatura e sobake; vaś varesave epitopură (Pcx thaj Shmt2), anθ-o tris-EDTA bufèro k-o 80°C (PH 9) ćhiven e kotora 25 minutură anθ-o than kadale pasoqo. Palal, e sekcie sas inkubirime e primarno antikorposa (dikh i Tabela S1) anθ-o blokàciaqo bufèro (3% BSA/PBS) anθ-o 4°C sasti raći e ćhivipnaça. O aver dives, e kotora sas thodine e blokirime buferosa thaj inkubirime e adekvatno fluoroforosa konjugirime sekundarno antitela 2 chasura ki temperatura e sobake; po agor, e kotora sas thodine mishto ano PBS, kontra-farbime e DAPI-aça, thaj palal kodoja sas phangle e AquaPolymount-eça Pe jekh mikroskoposko slajdo.
Jekh lasersko skanirimo konfokalno mikroskopo (TCS SP8-X vaj TCS Digital Light Sheet, Leica Microsystems) ekipirimo e parne lumiake laseresa thaj e 405 diode ultravioletno laseresa sas kerdo te dikhel pes o misal. Excitirindoj o fluoroforo thaj kidipe e signalosqo e Hybrid Detector-eça (HyDs), o softwèro LAS-X sas kerdo te kidel pes e śerutne imaźură save si konformo e Nyquist-esqe śerutnimatenqe anθ-o sekvenciàlo modo: vaś e na-kvantitativne panelură, si but dinamikane signàlură (sar egzàmplo, anθ-e somàtikane ćhelură thaj dendritură) mtY FPD te arakhen o gin e Hybrid PNR-enqo modo). O phanglipe katar 0.3 dži ko 6 ns si kerdo te ciknjarel pes o fundo.
Realno-vramako dikhipe e rangjarde čelalenge. Palal o ćhivipen anθ-o Neurobasal-A maśkar savo si les 1% B27 suplemento thaj 0,5 mM GlutaMax, e ćhelură sas sigo thodine pe poli-l-lizina-pherde śela (μ-Slide8 Pa, Ibidi, katalogosko gin 80826) , thaj palal kodoja sas ćhivdine anθ-o 37°C thaj 12% CO vaś jekh ćàso te mukhen e ćhelură stabilisarel. O dikhipen ano realo vaxt sas kerdo pe Leica SP8 lasersko skanirimo konfokalno mikroskopo ekipirimo e parne laserosa, HyD, 63×[1.4 numerikano apertura (NA)] uljesko objektivo lenso thaj jekh tato e tatosqo.
O ćoro sas sigo anestezirimo e karbono dioksidosa thaj ćhindlo o šero, o šero sas sigo ćhudino katar o šero, thaj ćhindo ande 200μm thulo (vaś 13C eksperimento e etiketàciaqo) vaj 275μm thulo (vaś duj fotonoske eksperimentură) sagitalno kotor pherdo e śerutne materiàlenθar O glazura (HM-605, VHer, Scientific Walldorf, Njamco) si pherdo kadale substancasa: 125 mM tato sar glazura, pherdo karbono (95% O2 thaj 5% CO2) tikno Ca2 + artificialno cerebrospinalno paj (ACSF) NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM natrium fosfato buferi, mM CO2, mM gluza 0.5 mM CaCl2 thaj 3.5 mM MgCl2 (osmotikano presipen 310 źi ka 330 mmol). Transferinen e lile kotora e mozgoske ki jekh pre-inkubaciaki soba savi si la maj baro Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM natrium fosfato buferi, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glukoza, 10 mM Ca. MgCl2) Maśkar) pH 7.4 thaj 310 źi ka 320 mmol).
Ko vakti e procesosko e imaging-esko, e kotora sas ćhivde ande jekh dedikuime imaging-soba, thaj o eksperimento sas kerdo telal kontinuo ACSF perfuzia pe jekh konstantno temperatura 32° źi ka 33°C. Jekh multifoton laser skanirimo mikroskopo (TCS SP8 MP-OPO, Leica Microsystems) ekipirimo e Leica 25x objektivno lensosa (NA 0.95, pani), Ti: Sapphire laser (Chameleon Vision II, Coherent) sas kerdo vash o slice imaging. FLIM modulo (PicoHarp300, PicoQuant).
FLIM katar Grx1-roGFP2. E paruvimata ano citoplazmatikano redox than e PN-enge sas merime kotar duj-fotonura FLIM ano sagitalno kotora e mozgoske, kote so o Grx1-roGFP2 biosenzori resljarda e PN-enge. Ano PN strato, o akvizitciako than si alosardo kotar 50 dži ko 80 μm telal o kotor e kotoresko te šaj te sigurinel pes kaj isi jekh PN (so si, o bibućaripe e perlengo strukturako ja neuronalno morfologikane paruvipa kotar e dendrite) thaj o dujto pozitivno roGFP2 senzori thaj AAV savo kodirinel shRNA PCx ja oleski kontrola sekvenca (ko-ekspresia mCherry). Kolektirinen jekh-stakoske slike 2x digitalno zoom [excitaciaki lungina: 890 nm; 512 nm 512 pikseli]. Detekcia: andruno HyD, fluorescein isothiocyanate (FITC) filter grupa] thaj image average andar 2 dži ko 3 minutia si kerdine te sigurinen pes kaj si kidine dosta fotonura (1000 fotonura ande sa) vash o kurko. I senzibilitèta e Grx1-roGFP2 sondaqi thaj i verifikàcia e FLIM kondicienqi sas kerdini monitorindoj o vaxt e źivdipnasko e roGFP2-esqo kana sas thodino exogeno 10 mM H2O2 anθ-o perfùziaqo ACSF (te maksimizisarel pes i oxidàcia, so kerel te vazdel pes o źivdipen), thaj palal kodoja thovindoj 2 mM dithiothreit (te tiknjarel pes o grad e redukciaqo tiknjaripe e źivdipnasko) (Figura S8, D źi ka G). Keren buti e FLIMfit 5.1.1 softveresa te analizisaren e arakhle rezultatura, te ćhiven e kurva e jekhutne eksponencialo xasaripnasqi e sasti image-esqi k-o mesurime IRF (funkcia e responsoski e instrumentosqi), thaj χ2 si aproksimativno 1. Te śaj te ginavel pes o źivdipen e jekhe PN-esqo, i maska ​​paśal o nervosko trupo sas xramosardi manualo, thaj sas kerdini jekh kvantifikàcia e źivdipnaski anθ-e svako maska.
Analiza e mitokondrialno potenciàlo. Palal so o akutno kotor sas inkubirime 100 nM TMRM direktno thodino ko perfuzime ACSF 30 minutura, e mitokondrialno potencijalno paruvimata e PN-enge sas mesurime kotar jekh duj-fotonsko mikroskopo. O TMRM-esqo dikhipen sas kerdo kana sas excitirime i sonda ko 920 nm thaj kana sas kerdo o andruno HyD (tetramethylrhodamine isothiocyanate: 585/40 nm) te kidel pes e signàlurǎ; kana hasnisaras i sasti excitàciaqi lungipen numaj kana hasnisaras jekh aver andruno HyD (FITC :525/50) te sikavas o mtYFP. Ker buti e ImageJ-esqo Image Calculator plug-in te evaluis o mitokondrialo potencijalo ko nivelo e jekhe ćhelurenqo. Ko skurto, i plug-in equàcia: signalo = min (mtYFP, TMRM) si kerdini te identifikisarel pes i mitokondriàlo rig savi sikavel o TMRM signalo anθ-o Purkinje Somali anθ-o jekh-stako konfokalno imàgo e korespondento kanalosqo. Palal kodoja o pixel area anθ-i maska ​​savi si kerdini si kvantifikuime, thaj palal kodoja si normalizirime p-o korespondento prago jekh-stako imàgo e mtYFP kanàlosqo te ovel o mitokondriàlo kotor savo sikavel o mitokondriàlo potenciàlo.
O tasvir sas dekonvolutirime e Huygens Pro (Scientific Volume Imaging) softveresa. Palal e skanime patretura e kaśtenqe, o montàźo e jekhe kaśtenqo si kerdo labǎrindoj o algoritmo vaś o automatikano śukaripen dino katar o LAS-X softwèro. Palal i kalibràcia e tasvirenqi, labăren o ImageJ thaj o Adobe Photoshop te śaj te procesisaren maj dur o tasviro thaj te laćharen jekhvar o śukaripen thaj o kontrasto. Ker buti e Adobe Illustrator-esa vaś e grafikani preparàcia.
mtDNA fokusoski analiza. O gin e mtDNA lezijengo sas kvantifikuime pe cerebellarno kotora markirime e antitelasa mamuj o DNA kotar o konfokalno mikroskopo. Sako ciljosko than sas kerdo vash o trupo e ćhelurenqo thaj o nukleo sakone ćhelurenqo, thaj i respektivno rig sas ginavdi labǎrindoj o Multi Measure plug-in (ImageJ softver). Te lel pes o nuklearno than katar o than e truposko e ćhelurenqo te ovel o than e citoplazmaqo. Po agor, o plug-in Analyze Particles (ImageJ softver) sas kerdo te śaj te kvantifikisarel pes automatikane e citoplazmatikane DNA punktură save sikaven mtDNA pe pragoski imàgi, thaj e resle rezultàtură sas normalizirime k-o PN-esqo prodùso e CTRL-esqe śuśenqo. E rezultatura si sikavde sar o prodùso gin e nukleozidurenqo anθ-jekh ćhel.
Analiza e proteinenqi ekspresia. Ker buti e ImageJ-esqo Image Calculator plug-in te evaluis e proteinenqi ekspresia anθ-o PN anθ-o nivelo e jekhe ćhelurenqo. Ko skurto, ano jekh-stratosko konfokalno dikhipe e korespondentno kanalesko, prekal i equàcia: signalo = min (mtYFP, antikorpo), o mitokondrialno regiono savo sikavel imunoreaktiviteto karing jekh antikorpo ki Purkina si identifikuime. Palal kodoja o pikselosko than anθ-i maska ​​savi si kerdini si kvantifikuime, thaj palal kodoja si normalizirime anθ-o korrespondento prago jekh-stako imàʒo e mtYFP kanàlosqo te ovel objavjime i mitokondriàlo frakcia e sikavde proteinosqi.
Analiza e densitàta e ćhelurenqi e Purkinje. O plug-in Cell Counter katar o ImageJ sas kerdo te evaluil e Purkinje densitàta kana ulavel pes o gin e Purkinje ćhelurenqo ginavdo katar o lungipen e cerebellarno ringosqo so si len e ginavde ćhelura.
Preparacia thaj kolekcia e mostrenqi. E mozgo katar e kontrolno grupa thaj e Mfn2cKO śuśe sas phangle anθ-o 2% PFA/2.5% glutaraldehid anθ-o 0.1 M fosfatno bufèro (PB), thaj palal kodoja sas kerdine e koronalne sekcie anθ-o labăripen e ciliàturenqo (Leica Mikrosysteme GmbH, Vienna, Austria) (Thickness 50 źi k-o 60 μm) O fiksàcia anθ-o bufèro anθ-o 1% PB tetraoksido thaj 1.5% kaliumo ferocianido ki temperatura e sobake 1 chaso. E kotora sas thodine trin drom e destilirime pajesa, thaj palal kodoja sas pherdo 70% etanolosa savo sas les 1% uranil acetato 20 minutura. E sekcie sas palal kodoja dehidrime anθ-o gradime alkoholo thaj thodine anθ-o Durcupan ACM (Araldite casting resin M) epoxy resin (Electron Microscopy Sciences, katalogo numero 14040) maśkar e śukar śukar śela, thaj po agor anθ-o 60°C Polimerizirime anθ-o furno 48 òre. O than e cerebellarno korteksosko sas alosardo thaj 50 nm ultrathin sekcije sas ćhinde pe Leica Ultracut (Leica Mikrosysteme GmbH, Vienna, Austria) thaj alosarde pe 2×1 mm bakresko ćororo ćororo pherdo polistirolo filmosa. E kotora sas farbime e soluciasa 4% uranil acetato ano H2O 10 minutia, thodine H2O butivar, palo odova Reynolds lead citrate ano H2O 10 minutia, thaj palo odova thovde H2O but droma. E mikrografura sas kerde e transmisiake elektronsko mikroskoposa Philips CM100 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) kotar e TVIPS (Tietz Video and Image Processing System) TemCam-F416 digitalno kamera (TVIPS GmbH, Gauting, USA). Njamco).
E śuśenqe infektuime e AAV-eça, o śero sas ulado thaj ćhindo anθ-i jekh 1 mm thuli sagitalno sekcia, thaj o cerebelum sas dikhlino labǎrindoj jekh fluorescèncaqo mikroskopo te identifikisarel pes o AAV-infektisardo ringo (so si, mCherry ekspresia). Numaj e eksperimentura ande save e AAV injekcia kerel jekh but bari transdukciaki efikasnost e Purkinje-esqe ćhelurenqi (vaś te phenas, paśe o sasto ćàso) anθ-e maj cïra duj śerutne ćàsurǎ si labărde. O AAV-transducime ćàso sas mikrodisektime vaś i raći palal i fiksacia (4% PFA thaj 2,5% glutaraldehid anθ-o 0,1 M kakaàto bufèro) thaj maj dur procesisardo. Palal o EPON-esqo ćhivipen, o fixno ćàso sas thovdo anθ-o 0.1 M natrium kokoàto bufèro (Applichem), thaj inkubirime anθ-o 2% OsO4 (os, Science Services; Caco) anθ-o 0.1 M natrium kokoàto bufèro (Applichem) 4 òre, palal kodoja sas thovdo 2 òre. Keren 3 drom 0.1 M kokamide buferosa. Palal, i serija e etanoloski savi vazdel pes sas kerdini te inkubisarel pes svako etanoloski solucia ko 4°C 15 minutia te dehidrinel pes o tkivo. O tkivo sas transferime ko propileno oxido thaj inkubirime sasti rat ko EPON (Sigma-Aldrich) ko 4°C. Thov o tkivo ano nevo EPON ki temperatura e sobake 2 chasura, thaj palo odova thov les ano 62°C 72 chasura. Utilizisar jekh ultramikrotomo (Leica Microsystems, UC6) thaj jekh diamantosko čhuri (Diatome, Biel, Švajcarija) te ćhines 70 nm ultratikne kotora, thaj te ćhines 1.5% uranil acetato 15 minutura ko 37°C, thaj te ćhines e solucia e citratosqo 4 minutură. E elektronsko mikrografura sas kerde kotar o JEM-2100 Plus transmisijako elektronsko mikroskopo (JEOL) ekipirime e Camera OneView 4K 16-bit (Gatan) thaj DigitalMicrograph softveresa (Gatan). Palal i analìza, e elektronosqe mikrografură sas line 5000× vaj 10,000× digitalo zumavipen.
Morfologikani analìza e mitokondrienqi. Sa e analìze, e kontùre e individualne mitokondrienqe sas manualo sikavde anθ-e digitalne imaźură labǎrindoj o softèro ImageJ. Diferentne morfologikane paramètrură si analizime. I mitokondriaki densitàta si sikavdi sar jekh procento so si dino kana ulavel pes i totalo mitokondriaki rig savi si savi ćhelja katar i rig e citoplazmaqi (i rig e citoplazmaqi = rig e ćhibăqi-i rig e nukleosqi e ćhibăqi) × 100. I śukaripen e mitokondrienqo si ginavdo anθ-i formula [4π∙(area/perimeter 2)]. I ista morfologia e mitokondrienqi sas analizime thaj ulavdi anθ-e duj kategorie (“tubularno” thaj “blister”) palal lenqe maj bare forme.
Analiza e numeroski thaj e densitàta e autofagozomenqi/lizozomenqi. Ker buti e softveresqo ImageJ te xramosares manualo e konturǎ vaś svako autofagozomo/lizozomo anθ-i digitàlo imàgi. O autofagozomo/lizozomo si sikavdo sar procento ginavdo kana ulavel pes o sasto autofagozomo/lizozomo strukturako than sakova ćheljako katar o than e citoplazmako (o than e citoplazmako=o than e ćhelurenqo-o than e nukleusosko)×100. I densitàta e autofagozomenqi/lizosomenqi si ginavdi kana ulavel pes o gin e autofagozomenqo/lizosomengo anθ-e jekh ćàso (anθ-o dikhipen e citoplazmàtikane rigăqo) (citoplazmàtikani rig = ćhelurenqi rig-nukleàro rig).
Etiketiribe vash akutno kotor thaj gatisaripe e mostrengo. Palal e eksperimentură save trubun te keren pes e glukozaqe etiketură, ćhiven e akutne kotora e mozgosqe anθ-i jekh pre-inkubaciaqi soba, savi si la saturaciaqo karbono (95% O2 thaj 5% CO2), baro Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM natrium fosfato bufèro, 2.5 mM NaCl mMH, 205 mM. d-glukoza, 1.0 mM CaCl 2 thaj 2.0 mM MgCl 2, ćhudino ko pH 7.4 thaj 310 ji ko 320 mOsm), kote so o glukoza si 13 C 6- Glukozaki substitucia (Eurisotop, katalogosko numero CLM-1396). Palal e eksperimentură save trubun te avel len piruvato, ćhiven e akutne kotora e śeresqe anθ-o maj baro Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM natriumo fosfato bufèro, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glukoza, 10 mM Ca.Cl thaj 20 MM Ad. MgCl2, ćhivel pes ko pH 7.4 thaj 310 źi ko 320mOsm), thaj thov 1mM 1-[1-13C]pyruvate (Eurisotop, katalogosko numero CLM-1082). Inkubirinen e kotora 90 minutia ko 37°C. Ko agor e eksperimentosko, e kotora sas sigo thovde ande jekh pajeski solucia (pH 7.4) savi sas la 75 mM amonium karbonato, thaj palal kodoja sas homogenizirime ande 40:40:20 (v:v:v) acetonitrilo (ACN): metanol: pani. Palal so e kotora sas inkubirime pe glazura 30 minutura, e mostre sas centrifugime pe 21,000 g 10 minutura pe 4°C, thaj o klaro supernatanto sas sušime ande jekh SpeedVac koncentrator. O rezultato e shushe metabolitesko peleto sas garavdo ko -80°C ji ko analiza.
Analiza e spektrometriaki e likvidno kromatografijaki e 13 C-markirime aminoacidencar. Palal i analìza e likvido kromatografia-masa spektrometria (LC-MS), o metabolìto peleto sas resuspendime anθ-e 75μl LC-MS grade pani (Honeywell). Palal i centrifugàcia 21,000 g vaś 5 minutură k-i 4°C, 20 μl e klarifikuime supernatàntosqo sas utilizisardo vaś i analìza e aminoàcidosqi, kana o aver kotor e ekstraktosqo sas sigo utilizisardo vaś i anìonàlo analìza (dikh maj tele). I analìza e aminoàcidenqi sas kerdini labǎrindoj o maj anglal deskripto protokolo vaś i derivàcia e benzoil kloridosqi (55, 56). Ano angluno paso, 10μl 100 mM natriumo karbonato (Sigma-Aldrich) sas thodino ko 20μl metabolitesko ekstrakto, thaj palo odova 10μl 2% benzoil klorido (Sigma-Aldrich) sine thodo ko LC grade ACN. O egzàmplo sas ćhudino skurto vràma thaj palal kodoja sas centrifugime k-o 21,000 g 5 minutură k-o 20°C. Transferisaren o ćhivdo supernatanto anθ-i jekh 2 ml autosampler flaska e konikane śelaça (200 μl volumo). E mostre sas analizime kotar o Acquity iClass ultra-high performance LC sistemo (Waters) phanglo e Q-Exactive (QE)-HF (Ultra High Field Orbitrap) bare rezoluciake precizno spektrometrosa (Thermo Fisher Scientific). Palal i analìza, 2μl e derivàciaqo egzàmplo sas injektime anθ-i jekh 100×1.0 mm bari-zorale silica T3 kolona (Waters) savi sas la 1.8μm partikle. O ćhivipen si 100μl/min, thaj o sistemo e buferesqo si kerdo kotar o bufèro A (10 mM amoniàqo formato thaj 0,15% formiko acido anθ-o pani) thaj o bufèro B (ACN). O gradiènto si sar so si: 0%B anθ-e 0 minutură; 0%B. 0 ji ko 15% B ko 0 ji ko 0.1 minutia; 15 ji ko 17% B ko 0.1 ji ko 0.5 minutia; B ko 17 dži ko 55% ko 0.5 dži ko 14 minutia; B ko 55 ji ko 70% ko 14 ji ko 14.5 minutia; ko 14.5 ji ko 70 ji ko 100% B ko 18 minutia; 100% B ko 18 ji ko 19 minutia; 100 źi ka 0% B ko 19 źi ka 19.1 minutură; 0% B ko 19.1 dži ko 28 minutia (55, 56). O QE-HF masesko spektrometro kerel buti ano pozitivno ionizaciako modo e masesko rango m/z (masako/charge ratio) kotar 50 dži ko 750. I aplikaciaki rezolucia si 60,000, thaj o gain control (AGC) ion targeto so si reslo si 3×106, thaj o maj baro ionesko vaxt si 1000 milikonde. O źanglipe e ionizaciaqo (ESI) kerel buti anθ-i jekh sprejoski tenzija 3,5 kV, jekh kapilarno temperatura 250°C, jekh śerutno śerutno śerutno 60 AU (arbitrarno jekhimata), thaj jekh śerutno śerutno śerutno 20 AU. 250°C. O S lensa si thodino pe 60 AU.
Anionoski kromatografia-MS analiza e 13C markerime organikane acidengi. O reslo metabolitosko precipitato (55μl) sas analizime kotar o Dionex ion kromatografijako sistemo (ICS 5000+, Thermo Fisher Scientific) phanglo e QE-HF mass spektrometrosa (Thermo Fisher Scientific). Ande skurto vrama, 5μl metabolitesko ekstrakto sas injektime ande jekh Dionex IonPac AS11-HC kolona ekipirime e HPLC-esa (2 mm×250 mm, partikulaki baripe 4μm, Thermo Fisher Scientific) ande push-in parcialno loop modo e pherdipnaske raportosa 1. ) Dionex IonPac AG1-HC AS11-HC kolona (250 mm HC guard kolona, 4μm, Thermo Fisher Scientific). I temperatura e kolonenqi si inkerdi k-o 30°C, thaj o autosampler si thodi k-o 6°C. Ker buti e kalium hidroksidosqi kartuša savi si dino e dejonizirime pajesa te kerel pes jekh kalium hidroksidosko gradiento prekal o eluento generatoro. Separacia e metabolitenqi anθ-i jekh ćorripen 380μl/min, aplikindoj kadava gradiènto: 0 źi k-e 3 minutură, 10 mM KOH; 3 źi ka 12 minutură, 10 źi ka 50 mM KOH; 12 źi ka 19 minutură, 50 źi ka 100 mM KOH; 19 źi ka 21 minutură, 100 mM KOH; 21 źi ka 21.5 minutură, 100 źi ka 10 mM KOH. I kolona sas pale ekvilibrime telal 10 mM KOH 8.5 minutia.
E eluime metabolitura si kombinime e 150μl/min izopropanol suplementosko palo kolona thaj palal kodoja si bičhalde ko jekh spektrometro e bare rezoluciako savo kerel buti ko negativno ionizaciako modo. MS dikhel o spektro e masengo katar m/z 50 dži ko 750 e rezoluciasa 60,000. O AGC si thodino pe 1×106, thaj o maj baro ionosko vaxt si 100 ms. O tato ESI źanglipe sas kerdo buti e sprejosa 3.5 kV. E aver paramètrură le ionosqe źanglimaske si kadala: kapilarno temperatura 275°C; ćhivipen e gazesqo anθ-o śero, 60 AU; aźutipnasko gazosko ćhivipen, 20 AU ko 300°C, thaj S lensaqo ćhivipen ko 60 AU.
Analiza e datengo e 13C markerime metabolitencar. Ker buti e TraceFinder softveresa (verzia 4.2, Thermo Fisher Scientific) vaś i analìza e datengo pal-o raporto e izotopenqo. I identitèta svakone komponentosqi sas verifikuime katar jekh patǐvalo referèncaqo komponento thaj sas analizime bi-phangle. Te śaj te kerel pes i analìza e barvalipnasqi e izotopenqi, i rig e ionosqi kromatogramosqi (XIC) savi si avri ćhudini (XIC) vaś svako 13C izotopo (Mn) sas ćhudini kaθar [M + H] +, kaj n si o gin e karbonosqo e śerutne komponentosqo, kerdo te analizisarel pes e aminoàcide vaj [ MH] + si kerdo te analizisarel pes e anionură. I masaqi ćaćutnipen e XIC-esqi si maj tikni sar panз kotora anθ-o miliono, thaj i ćaćutnipen e RT-esqi si 0.05 minutură. I analìza e barvalipnasqi si kerdini kana ginavel pes o raporto maśkar svako arakhlo izotopo thaj i summa sa e izotopurenqi e korrespondentno komponèntosqi. Kadala raportura si dine sar procentualno valutura vash sako izotopo, thaj e rezultatura si sikavde sar molarno procentualno barvalipe (MPE), sar so sas deskriptirime maj anglal (42).
O ćororo neuronosko peleto sas homogenizirimo ano 80% metanol (v/v) tato sar glazura, vortexirime, thaj inkubirime ko -20°C 30 minutia. Vortexisar o proba pale thaj ćhivel les ko +4°C 30 minutura. O egzàmplo sas centrifugime k-o 21,000 g vaś 5 minutură k-o 4°C, thaj palal kodoja o supernatanto savo areslo sas kidino thaj śukar kerdo anθ-o SpeedVac koncentràtoro k-o 25°C vaś maj palal analìza. Sar si deskriptirime opral, LC-MS analìza sas kerdini pe aminoàcide e ćhelurenqe. Ko TraceFinder (verzia 4.2, Thermo Fisher Scientific), i analìza e datengo sas kerdini labǎrindoj i monoizòtopikani masa svakone komponentosqi. I kvantilno normalizàcia e metabolitosqe datengo sas kerdini labǎrindoj o preprocessCore softverosqo paketo (57).
Preparacia e kotorenqi. O ćoro sas sigo anestezirimo e karbonosko dioksidosa thaj ćhindlo o šero, o šero sas sigo ćhudino katar o šero, thaj o vibraciako ćhuri pherdo glazura (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Njamco) sas kerdo te ćhinel les anθ-e 300 źi ka 375 μm sagitalne kotora karbono gazifikacia (25%) Tikno Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM sodium phosphate buffer, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glukoza, 1.0 mM CaCl2 thaj 6.0 mM MgCl2 Adjutisarel pes ko pH 4 thaj 3 mO 30). Transferin le śeresqe kotora save si line anθ-i jekh soba savi si la maj baro Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM sodium phosphate buffer, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glukoza, 4.0 mM Ca2 mM thaj 5 MM pH 7.4 thaj 310 źi ka 320 mOsm). Garav e kotora 20 dži ko 30 minutia te šaj te oven restaurime anglal o snimki.
registracia. Jekh mikroskoposko than ekipirimo e fixno registraciake thana thaj 20x pani imerzijako objektivo lensa (Scientifica) sas kerdo vash sa e registracie. E putativno Purkinje čelalja sas identifikuime katar (i) barope e truposko, (ii) anatomikano than e cerebelumosko, thaj (iii) ekspresia e fluorescentno mtYFP reporter genesko. I pipeta e patch-esqi savi si la jekh rezistènca e śeresqi 5 źi ka 11 megohms si avri ćhudini katar jekh kapilàro e borosilikatosqo (GB150-10, 0.86 mm×1.5 mm×100 mm, Science Products, Hofheim, Germany) thaj jekh horizontàlo pipeta Instruments (P-10000), Sutterva, CA). Sa e registràcie sas kerde katar o ELC-03XS npi patch clamp amplifier (npi electronic GmbH, Tam, Germany), savo sas kontrolisardo katar o softwèro Signal (verzia 6.0, Cambridge Electronic, Cambridge, UK). O eksperimento sas registrime pe jekh śerutnipen 12.5 kHz. O signalo si filtrime duje skurto-pasoske Bessel filtrenca save si len frekvence 1.3 thaj 10 kHz respektivno. I kapaciteta e membranaqi thaj e pipetaqi si kompenzirime katar o kompenzàciaqo cirkuito labǎrindoj o amplifikatòro. Sa le eksperimentura sas kerde telal o kontrolo e Orca-Flash 4.0 kamerako (Hamamatsu, Gerden, Njamco), savi sas kontrolisardi katar o Hokawo softver (verzia 2.8, Hamamatsu, Gerden, Njamco).
Rutinikani konfiguràcia thaj analìza e sasti ćhelurenqi. Sigo anglal o xramosaripen, pheren i pipeta e andrune soluciaça savi si la kadala substancură: 4.0 mM KCl, 2.0 mM NaCl, 0.2 mM EGTA, 135.0 mM kaliumo glukonàto, 10.0 mM Hepes, 4.0 mM ATP (MM gmM), 5 mM Gunofosifato. (GTP) (Na) thaj 10.0 mM kreatinina fosfato sas phangle ko pH 7.25, thaj o osmotikano presipe sas 290 mOsm (sukroza). Sigo palal o thovipen e zorako 0 pA te phagel pes i membrana, sas merimo o potencijalo e membranako so ačhilo. O inputno resipe si merimo kana thoven pes hiperpolarizirime ćorre -40, -30, -20, thaj -10 pA. Mezij o barope e tenzijako thaj utilizin o Ohm-esko zakono te ginaves o inputno resipe. I spontano aktivitèta sas xramosardi anθ-i jekh voltaźaqi klàmpa vaś 5 minutură, thaj o sPSC sas identifikisardo thaj mesurime anθ-o Igor Pro (verzia 32 7.01, WaveMetrics, Lake Oswego, Oregon, USA) labǎrindoj jekh semi-automatikano prinźaripenqo skripto. I IV kurva thaj o stabilno ćororo si meśime kana phandel pes i baterija pe diferentne potenciàlurǎ (astarindoj katar -110 mV) thaj vazdel pes o tenzija anθ-e 5 mV paśa. I produkcia e AP-esqi sas testime kana sas thodino jekh depolarizàciaqo ćorripen. Phandel e ćhelja ko -70 mV kana kerel pes depolarizàciaqo pulso. Keren o barodipen e paśenqo vaś svako registraciaqo jekhipen (10 źi ka 60 pA). Keren i ginavipen e maj bari AP frekvenca manualno ginavindoj e pulsoske śpike save keren e maj bari AP frekvenca. O AP prago si analizime kotar o dujto derivato kotar o depolarizaciako pulso savo angluno drom kerel jekh ja maj but AP.
Konfiguracia thaj analiza e perforime thana. Keren perforime registracia e patch-esqi labǎrindoj standardo protokolură. Ker buti e ATP- thaj GTP-bi pipeta savi na si la kadala ingrediensura: 128 mM glukonato K, 10 mM KCl, 10 mM Hepes, 0.1 mM EGTA thaj 2 mM MgCl2, thaj ćhivel pes ko pH 7.2 (kerindoj KOH). ATP thaj GTP si avri shudine katar e intracelularno solucia te na avel bikontrolirimi permeabiliteta e celloski membranaki. I pipeta e patch-esqi si pherdi anθ-i jekh andruni solucia savi si la amfotericin (paśe 200 źi ka 250μg/ml; G4888, Sigma-Aldrich) te lel pes jekh perforisardo patch-esqo rekordo. O amfotericin sas ćhivdo anθ-o dimetil sulfoksido (agorutni koncentràcia: 0,1 źi k-o 0,3%; DMSO; D8418, Sigma-Aldrich). I koncentràcia e DMSO-qi savi sas labărdi na sas la jekh signifikantno efekto p-e neuronură save sas studime. Ko vakti e procesosko e ćhivipnasko, o kanalo resipen (Ra) sas monitorisardo sajekh, thaj o eksperimento sas astardo palal so i amplitùda e Ra thaj AP sas stabilizirime (20-40 minutură). I spontano aktivitèta si merime anθ-i jekh tenzija thaj/vaj anθ-i ćorri 2 źi k-e 5 minutură. I analìza e datengo sas kerdini anθ-o Igor Pro (verzia 7.05.2, WaveMetrics, USA), Excel (verzia 2010, Microsoft Corporation, Redmond, USA) thaj GraphPad Prism (verzia 8.1.2, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA). Amerikake Thema). Te śaj te identifikisarel pes e spontano AP-ură, o IgorPro-esqo NeuroMatic v3.0c plug-in si utilizime. Identifikuin automatikane AP-ură labǎrindoj jekh dino prago, savo si ćhudino individualo vaś svako rekordo. Ko utiliziribe e spike intervalo, determinisar e spike frekvenca e maj bari instantno spike frekvencasa thaj e mashkarune spike frekvencasa.
PN izolàcia. Adaptirindoj pes ko maj anglal publicirimo protokolo, PNs sas purime kotar o cerebelo e ćororesko ko specifiko stadiumo (58). Ko skurto, o cerebelo sas disektirime thaj ćhivdo ano tato disociaciako mediumo [bi HBSS Ca2+ thaj Mg2+, pherdo 20 mM glukoza, penicilina (50 U/ml) thaj streptomicina (0.05 mg/ ml)], thaj palo odova digestirime o mediumo ano papain [HBSS, suplementirimo steina (1 mg / ml), papain (16 U / ml) thaj deoxyribonuclease I (DNase I; 0.1 mg/ml)] Tretirinen 30 minutia ko 30°C. Anglal thoven e tkivo ano HBSS mediumo savo si les o ćoro (10 mg/ml), BSA (10 mg/ml) thaj DNase (0.1 mg/ml) ki temperatura e sobake te na kerel pes enzimatikani digestia, thaj palal kodoja ano HBSS mediumo savo si les 20 mM glukoza Kovles te ćhivel pes ko HBSS peillin, peillin/ml/ml (0.05 mg/ml) thaj DNase (0.1 mg/ml) mukhen jekh ćhelura. I suspenzia e ćhelurenqi savi reslăs sas filtrime anθ-o 70μm ćhelurenqo filtro, palal kodoja e ćhelură sas ćhudine anθ-i centrifugàcia (1110 rpm, 5 minutură, 4°C) thaj resuspendime anθ-o śerutno maśkar [HBSS, suplementisardo 20 mM glukoza, 20% fetalno bovino ) Serum, pelinic (50/0) (0.05 mg/ml)]; evaluisaren i źivdipen e ćhelurenqi e propidium iodidosa thaj ćhiven i densitàta e ćhelurenqi 1×106 źi ka 2×106 ćhelura/ml. Anglal i citometria e ćhibăqi, i suspenzia sas filtrisardi anθ-o jekh 50 μm ćhibăqo ćhivipen.
Citometro e fluxosko. O ćhivipen e ćhelurenqo sas kerdo ko 4°C labǎrindoj i maśina FACSAria III (BD Biosciences) thaj o softèro FACSDiva (BD Biosciences, verzia 8.0.1). I suspenzia e ćhelurenqi sas xramosardi labǎrindoj jekh 100 μm ćàso telal jekh presia 20 psi anθ-i jekh rèta ~2800 evenimentură/sek. Sar e tradicionalno kriteriumura vash o phandipe (baripe e ćhelurenqo, bimodalno diskriminacia, thaj karakteristike e ćhivipnaske) naśti te sigurin i laćhi izolàcia e PN-esqi katar aver ćhelurenqe tipuria, i stratègia vaś o phandipe si thodini bazirime pe direkto komparacia e YFP intenzitetosqi thaj autofluorescèncaqi anθ-e mitoYFP+ ​​thaj anθ-o kontrolo mitoYFP − Mice. O YFP si excitime kana irradiacia e probako 488 nm lasersko linie, thaj o signalo si detektirimo kotar o 530/30 nm band pass filter. Ano mitoYFP+ ​​ćirikle, i relativo zor e Rosa26-mitoYFP reporter genesqi si vi utilizirime te dikhel pes o neuronalno trupo thaj o axonoske kotora. 7-AAD si excitime e 561 nm lole laseresa thaj si detektirime e 675/20 nm bandpass filtrosa te na avel mule celi. Te śaj te ulaven pes e astrocitură anθ-o jekh vaxt, i suspenzia e ćhelurenqi sas farbime e ACSA-2-APC-eça, palal kodoja o egzàmplo sas irradime e 640 nm lasersqe linieça, thaj jekh 660/20 nm bandpass filtro sas utilizisardo te dikhel pes o signàlo.
E kidine ćhelura sas ćhudine ande centrifugàcia (1110 rpm, 5 minutură, 4°C) thaj garavde k-o -80°C źi kana sas labărde. Mfn2cKO śuśe thaj lenqe ćhave si klasifikuime anθ-o jekh dives te śaj te tiknjarel pes i procedùraqi varìabilitèta. I prezentàcia thaj i analìza e FACS-esqe datengo sas kerde anθ-o softwèro FlowJo (FlowJo LLC, Ashland, Oregon, USA).
Sar so si phendo opral (59), o PCR ano realo vaxt si kerdo te izolisarel o DNA kotar e sortirime neuronura vash o mtDNA kvantifikàcia maj palal. I linearitèta thaj i pragoski senzibilitèta sas anglunes testime kana sas kerdo qPCR pe diferentne gindura e ćhelurenqe. Ko skurto, kiden 300 PN ano jekh lizako buferi savo si kerdo kotar 50 mM tris-HCl (pH 8.5), 1 mM EDTA, 0.5% Tween 20 thaj proteinaza K (200 ng/ml) thaj inkubirinen ko 55°C 120 minutia. E ćhelura sas maj dur inkubirime ko 95°C vaś 10 minutură te avel sigurime jekh pherdo inaktivàcia e proteinazaqi K. Utilizindoj jekh TaqMan sonda (Thermo Fisher) specifiko vaś o mt-Nd1, o mtDNA sas mesurime katar o semi-kvantitativo PCR anθ-o 7900HT Real-Time PCR sistemo (Thermoherific Scientifics). Science, katalogosko numero Mm04225274_s1), mt-Nd6 (Thermo Fisher Scientific, katalogosko numero AIVI3E8) thaj 18S (Thermo Fisher Scientific, katalogosko numero Hs99999901_s1) gene.
Preparacia e proteomeske mostrenqi. Te tatol pes i solucia 95°C 10 minutură thaj te kerel pes sonikàcia, anθ-o bufèro e lizaqo [6 M guanidin klorido, 10 mM tris(2-karboksietil) fosfin hidroklorido, 10 mM kloroacetamid thaj 100 mM tris-Lìza ćhivdine neuronură anθ-e HC peletură]. Pe Bioruptor (Diagenode) 10 minutura (30 sekunde pulso / 30 sekunde pauza). O egzàmplo sas diluime 1:10 anθ-o 20 mM tris-HCl (pH 8.0), miksardo anθ-o 300 ng trypsin gold (Promega), thaj inkubirime sasti raći anθ-o 37°C te aresel pes jekh pherdo digestia. Pe dujto dives, o egzàmplo sas centrifugime 20,000 g 20 minutură. O supernatanto sas diluirimo 0.1% formikano acidosa, thaj i solucia sas desolime e korkoro-kerde StageTips-esa. O misal sas sušime ano SpeedVac instrumento (Eppendorf koncentrator plus 5305) ko 45°C, thaj palo odova o peptido sas suspendirimo ano 0.1% formic acid. Sa e mostre sas kerdine simultano katar jekh manuš. Te śaj te analizisarel pes e astrocitenqe mostre, 4 μg desaltime peptidură sas markisarde jekh tandem mass tag (TMT10plex, katalogosqo gin 90110, Thermo Fisher Scientific) jekh peptido thaj TMT reagènto raporto 1:20. Palal o TMT-esqo markeripe, 0.8 mg TMT-esqo reagenso sas resuspendime anθ-e 70 μl anhidro ACN, thaj o śukar peptido sas rekonstituisardo anθ-e 9 μl 0.1 M TEAB (triethylammonium bikarbonate), kaj sas thodino 7 μl TMT reagenso anθ-o ACN. I koncentràcia sas 43.75%. Palal 60 minutură inkubacia, i reakcia sas ćhivdi 2 μl 5% hidroksilaminaça. E etiketirime peptidura sas kidine, sušime, resuspendime ande 200μl 0.1% formic acid (FA), ulade ande duj, thaj palal kodoja sas desolime kotar o StageTips kerdo korkoro. Ko UltiMate 3000 ultra high performance liquid chromatograph (UltiMate 3000 ultra high performance liquid chromatograph), jekh kotar e duj kotora sas frakcionirimo pe 1mm x 150mm Acquity kromatografikani kolona pherdi 130Å1.7μm C18 partikle (Waters, katalogo No: SKU 1966). Thermo Fisher Scientific). Separacia e peptidenqi anθ-o jekh ćàso 30μl/min, ulav katar 1% źi k-o 50% bufèro B vaś 85 minutură anθ-o jekh gradiento 96 minutură, kaθar 50% źi k-o 95% bufèro B vaś 3 minutură, palal kodoja 8 minutură vaś 95 % bufer B; O buferi A si 5% ACN thaj 10 mM amonium bikarbonato (ABC), thaj o buferi B si 80% ACN thaj 10 mM ABC. Kiden e frakcie sako 3 minutura thaj thon len ande duj grupe (1 + 17, 2 + 18, etc.) thaj shushen len ande jekh vakuumoski centrifuga.
LC-MS/MS analiza. Palal i spektrometria e masenqi, e peptidură (numero r119.aq) sas ulade pe jekh 25 cm, 75 μm andruno diametro PicoFrit analitikane kolona (nevo objektivo lensa, kotor gin PF7508250) ekipirime 1.9 μm ReproSil-Pur 120 C18-AQD medium (Maischr, UAS-YAS). 1200 (Thermo Fisher Scientific, Njamco). I kolona sas inkerdi ko 50°C. E bufera A thaj B si 0.1% formikano acido ano pani thaj 0.1% formikano acido ano 80% ACN, respektivno. E peptidura sas ulade katar 6% źi ka 31% buferi B vaś 65 minutură thaj katar 31% źi ka 50% bufèro B vaś 5 minutură anθ-o gradiento 200 nl/min. E eluime peptidura sas analizime pe jekh Orbitrap Fusion mass spectrometer (Thermo Fisher Scientific). O peptidosko prekursoro m/z meripe si kerdo e rezoluciasa 120,000 ano rango 350 dži ko 1500 m/z. Ko utiliziribe 27% normalizirime energia e kolìziaqi, o maj zuralo prekursoro e charge-esqo 2 źi ka 6 si alosardo vaś o baro energiako C trap disociacia (HCD) ćhivipen. O vaxt e ciklosqo si thodino ko 1 s. O m/z valuto e peptidosko kotor sas merimo ano ion trapo kotar o maj tikno AGC targeto 5×104 thaj o maj baro injekciako vaxt 86 ms. Palal i fragmentàcia, o prekursoro sas thodino anθ-i lista e dinamikane ekskluziaqi vaś 45 s. E TMT-markirime peptidura sas ulade pe 50 cm, 75 μm Acclaim PepMap kolona (Thermo Fisher Scientific, katalogosko numero 164942), thaj e migraciake spektrura sas analizime pe jekh Orbitrap Lumos Tribrid mass spectrometer (Thermo Fisher Scientific) ekipirimo e bare-simetrikane valencar (IMS) o ekipmento (Thermo Fisher Scientific) kerel buti pe duj kompenzaciake tenzije −50 thaj −70 V. MS3 alosardo bazirime pe sinhronizaciako prekursoro si kerdo vash TMT raporto ion signalosko meripe. I separacia e peptidosqi sas kerdini pe EASY-nLC 1200, labǎrindoj jekh 90% linearno gradientosqi elucia, e bufèrosqi koncentràcia 6% źi ka 31%; o tampon A sas 0.1% FA, thaj o tampon B sas 0.1% FA thaj 80% ACN. I analitikani kolona kerel buti ko 50°C. Koristinen o FreeStyle (verzia 1.6, Thermo Fisher Scientific) te ulaven o originalno lil palal o FAIMS kompenzaciako tenzija.
Identifikacia thaj kvantifikàcia e proteinenqi. Ko utiliziribe e integrime Andromeda rodipasko motori, e originalno data sas analizime kotar o MaxQuant verzia 1.5.2.8 (https://maxquant.org/). Po dur katar e Cre rekombinaza thaj YFP sekvence save si line katar e Aequorea victoria, e spektrura e peptidoske fragmentoske sas rodine vash e kanonikani sekvenca thaj i izoformaki sekvenca katar o proteomo e ćororesko (Proteome ID UP000000589, tele lino katar o UniProt ando Maj 2017) . I oxidàcia e metioninosqi thaj i acetilàcia e proteinenqi N-terminàlo sas thodine sar varìàbilne modifikàcie; e metilacia e cisteinaqi  karbamoil sas thovdi sar fixno modifikàcie. E paramètrură vaś o xasaripen si thodine anθ-o “specificiteto” thaj “trypsin/P”. O minimalno gin e peptidurenqo thaj e peptidurenqo e śuźe śeresqo so si labărde vaś i identifikàcia e proteinurenqi si 1; o minimalno gin e unikalune peptidurenqo si 0. Telal e kondicie e peptidosqe mapaqe malavipenqe, i proteinaqi identifikàcia sas 0.01. I opcia “Dujto Peptido” si aktivirimi. Ker buti e opciasa “match between runs” te transferis suksesutne identifikacie maškar diferentne originalne fileura. Utilizin LFQ minimalno raporto gin 1 vash e kvantifikacia bi etiketako (LFQ) (60). I LFQ intenziteta si filtrime vaś maj cïra duj validne valutură anθ-e maj cïra jekh genotip grupa anθ-o svako vaxt, thaj si ekstrapolime kaθar jekh normalo distribùcia savi si la jekh śirdipen. 0.3 thaj te ćhivel pes tele 1.8. Ker buti e Perseus kompjuterikane platformasa (https://maxquant.net/perseus/) thaj R (https://r-project.org/) te analizis e LFQ rezultatura. Jekh duj-drom moderatno t-test katar o limma softverosko paketo sas kerdo vash e diferencijalno ekspresiaki analiza (61). I analìza e eksploràciaqe datengo si kerdini labǎrindoj o ggplot, FactoMineR, factoextra, GGally thaj pheatmap. E TMT-bazirime proteomikane date sas analizime kotar o MaxQuant verzia 1.6.10.43. Roden e suro proteomikane date katar e UniProt-esko manušikani proteomikani databaza, savi sas tele lino ando Septembro 2018. I analìza inćarel o faktòro vaś i korekcia e izotoposqi puripenqi dino kaθar o fabrikanto. Ker buti e limma anθ-o R vaś i analìza e diferenciàlo ekspresiaqi. E originalne date, e rezultatura e rodipnaske e databazake, thaj e dataki analiza e butjako thaj e rezultatura si sa garavde ande ProteomeXchange aliansa prekal o PRIDE partneresko depozito e data set identifikatorosa PXD019690.
E funkcionalne anotacie barvaren i analìza. O Ingenuity Pathway Analysis (QIAGEN) instrumento sas kerdo te dikhel pes o barvalipe e funkcionalno anotaciake terminengo e datako set ko 8 kurke (Figura 1). Ko skurto, i kvantitativno lista e proteinenqi savi si kerdini katar o LC-MS/MS (tandem mass spectrometry) analiza e datengo si utilizirime e śerutne kriterijencar: O Mus musculus si alosardo sar i specia thaj o fundo, thaj i kategoria sikavel o P-vaxt ajutisardo katar o Benjamini vaś o barvalipe 0.05 vaj maj tikno si konsiderime sar signifikantno. Palal kadava grafiko, si sikavde e maj bare panз maj but kategorie anθ-e svako grupa bazirime p-o P-esqo ćhinavipen. Ko buteder t-test, ko duj-stepeno linearno vazdipesko programo kotar o Benjamini, Krieger, thaj Yekutieli (Q = 5%), kerel pes i analìza e proteinenqi ekspresia anθ-o vaxt anθ-e importanto kandidatură identifikuime anθ-e svako kategoria, thaj svako rèndo si analizime averhande. Na trubul te adoptisarel pes jekh konzistento SD.
Te śaj te keras komparacia maśkar e rezultatură kadale studiaqe e publikime databazenqe thaj te keras jekh Venn diagramo anθ-i Figura 1, ame kombinisaras i kvantitativno lista e proteinenqi e MitoCarta 2.0 anotacienqe (24). Koristinen o online instrumento Draw Venn Diagram (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/) te keren o diagramo.
Palal detalura palal e statistikane procedure save si hasnime vaś e proteomikani analìza, mangas tumen te dikhen i sekcia savi si la Materialură thaj Metode. Vaś sa e aver eksperimentură, detalìzuime informàcie śaj te arakhen pen anθ-i korespondentno legenda. Te na si specifikuime aver rig, sa e date si sikavde sar maśkar ± SEM, thaj sa e statistikane analìze sas kerde anθ-o GraphPad Prism 8.1.2 softwèro.
Palal maj but materiàlură vaś kadava lil, mangas tumen te dikhen http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1
Kado si jekh putardo akceso artiklo distribùime telal e kondicie le Creative Commons Attribution-Non-Commercial License, savo del śajsaripen te labărel pes, te del pes thaj te kerel pes reprodukcia anθ-e savi-te-avel medium, źi kana o agorutno labăripen na si vaś komercialno laćhipen thaj i premisa si ke i originalo buti si ćaći. Referìnca.
Nota: Amen mangas tumendar numaj te den tumari e-mail adresa, kadja kaj o manuš savo rekomendisaren les ki rig te džanel kaj kamen te dikhen o e-mail thaj kaj na si spam. Amen na ka astaras nisave e-mail adrese.
Akava pućhipen si kerdo te testisarel pes te san vizitanto thaj te arakhel pes o automatikano bićhaldipen e spam-esqo.
Katar E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
E proteomikani analìza e disfunkcionalne neuronurenqi sikavdăs ke e metabolikane programură si aktivisarde te keren kontra e neurodegeneràciaqe.
Katar E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
E proteomikani analìza e disfunkcionalne neuronurenqi sikavdăs ke e metabolikane programură si aktivisarde te keren kontra e neurodegeneràciaqe.
©2020 Amerikani Asociàcia vaś o Anglunipe e Scienciaqo. sa le hakaja si garavde. AAAS si partneri e HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef thaj COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.