Akana†Akanutni adresa: OX11 0DE, UK, Diamond Building, Harwell Science and Innovation Park, Dietcote, Oxfordshire, UK, Diamond Light Source Co., Ltd., Electronic Biological Imaging Center.
O komplekso 1 (RC-LH1) si o fotosintetikano kotor e lila fototrofikane bakteriengo. Amen introducisardam duj krio-elektronikane mikroskopikane strukture katar o RC-LH1 komplekso katar o Rhodopseudomonas palustris. I 2.65-Å rezoluciaqi struktura e RC-LH114-W kompleksosqi si kerdini katar 14 subunit LH1 śerutne save si krujal o RC, savo si phandlo katar o proteino W, kana o komplekso bi proteinosko-W si pherdo RC kompozicia krujal o RC. Phandlo 16 subunitetura LH1 ćàso. I komparacia kadale strukturenqi del dikhipen pal-i dinamika e kinonesqi anθ-o RC-LH1 komplekso, inkluziv e maj anglal na-determinisarde konformaciaqe paruvimata kana phandel pes o kinono anθ-o than RC QB, sar vi i lokacia e aźutipnaske phanglimaske thana e kinonesqi, save aźutil te nakhen len anθ-o RC. I unikalno struktura e W proteinosqi na mukhel te phandel pes o LH1-esqo ćàso, kadja ke kerel pes jekh kanàlo vaś te akcelerisarel pes o paruvipen e quinone/quinolone.
I energia savi del i fotosinteza śaj te inkrel sa o źivdipen ki phuv, thaj si la baro potencijalo vaś e solarno bioteknologia. Kana promovirinen e globalno fotosinteza, e lila fototrofikane bakterie sikaven vi diferentno energikane modurja thaj metabolikane kapacitetura. Von śaj te na keren fotosinteza thaj te barǒn sar heterotrofikane bakterie anθ-o tuniariko, śaj te laćharen o azoto thaj o diòksido e karbonosqo, te keren o hidrogeno, thaj te phagen e aromatikane komponentură (1-3). Te śaj te del pes energia kadale procesurenqe, i lumja trubul te avel sigo thaj efikasno paruvdi anθ-i khemikani energia. Akava proceso kezdisarel pes kana o komplekso e antenako savo astarel e lumia absorbiril e lumia thaj transferil e astardi energia ko reakciako centro (RC), odolesqe astarel pes i separacia e charge-eski (4 – 7). I bazaki jekhin e fotosintezaki ande lila fototrofikane bakterie si kerdini katar o tipo 2 RC, krujal o komplekso 1 (LH1), savo kerel o RC-LH1 kerdo komplekso. LH1 si kerdo katar jekh matrica e kurve αβ heterodimerenqi, savi phandel duj bakteriàlo klorofilo (BChl) a molekule thaj jekh vaj duj karotenoidura (8-12). I maj lokho LH1 antena si kerdini katar 16 vaj 17 αβ heterodimerura save cirden o RC (9-13) ande jekh phandlo ćàso, numaj anθ-e aver śerutne kompleksură, e transmembràne peptidură phagen i kontinuitèta e LH1-esqi savi si paśal late, kadja promovisaren i difuzia e kinol/kinonosqi maśkar o RC thaj o cytochrome bc komplekso (1111, 13). I lila fototrofikani planta Rhodopseudomonas (Rps.) si modelo organismo savo śaj te haćarel i energia thaj o transfero e elektronurenqo savo źutil i fotosinteza. I angluni kristalno struktura si Rps. O modelo e palustris RC-LH1 kompleksosko si RC, phanglo 15 heterodimerikane LH1 ćorrenca, save si phanle katar jekh bipinʒardo proteino akhardo “Protein W” (14). O proteino-W sas maj palal identifikuime sar RPA4402, savo si jekh bi-karakterizirimo 10.5kDa proteino trin prediktime transmembranikane helikenca (TMH) (16). Amen propozisaras te paruvas o anav e rpa4402 genesko savo kodisarel o proteino W ko pufW te ovel konzistento e nomenklaturasa savi si kerdini vash e gene save kodirinen RC-L, M (pufL, pufM) thaj LH1α, β (pufA, pufB) subunitetura. Interesno, o proteino-W si numaj ko 10% kotar o RC-LH1, so sikavel Rps. palustris kerel duj diferentne RC-LH1 kompleksura. Kathe, raportisaras e bari rezoluciaqe cryo-EM (cryo-EM) strukture duje śerutne kompleksurenqe, jekh e proteina W thaj 14 αβ heterodimerură, o aver bi proteinosqo W thaj jekh phandlo 16 Heterodimer LH1 śerutno. Amari struktura reprezentil jekh paso paruvipe ano haćaripe e RC-LH1 kompleksosko e Rps. palustris, soske amen analizisardam i homogeno populacia savi si sajekh variànta thaj si amen dosta rezolucia te śaj te asignisaras sajekh peptido thaj phangle pigmentură thaj relaciaqe lipidură thaj kinone. I komparacia kadale strukturenqi sikavel kaj e trin TMH proteine-W save na sas arakhline anθ-e aver RC-LH1 kompleksură źi akana keren jekh kanàlo vaś o kinon te śaj te akcelerisarel o paruvipen e kinonosqo/kinonosqo. Identifikuime si jekh gin e garavde thana save phanden pes e lipidenca thaj e kinonença, thaj sikavdam jekh nevo paruvipen e konformaciaqo palal i kombinàcia e kinoneski thaj e RC-esqi, savi śaj te avel laćhi vaś o fotosistemo II (PSII) RC e oksigenime fototrofikane organismurenqo. Amare arakhadipa den neve dikhimata pe kinetika e phanglimaski thaj paruvipnaski e quinone/quinolone ano RC-LH1 kerdo komplekso e lila fototrofikane bakteriengo.
Te śaj te kerel pes jekh detalìzo studiàcia pal-e duj kompleksură arakhline anθ-e Rps. palustris, amen izolisaras svako RC-LH1 biokemikane metodenca. O proteino W-deficitno komplekso (maj dur akhardo sar ΔpufW) sas purifikuime katar o shtampo savo nas les o pufW gene (16), thaj numaj jekh RC-LH1 komplekso śaj te avel kerdo. O proteino W-komplekso si kerdo katar jekh shtampo. O proteino W kadale shtamosqo si modifikuime 10x His tag-eça anθ-o lesqo C-terminus, kadja kaj o proteino W-esqo komplekso śaj te avel efektivno kombinisardo e maj but bi-proteinosqe W katar o imobiliziripen e metalosqo. O komplekso si efektivno ulavdo (16) Afinitetoski Kromatografia (IMAC).
Sar si sikavdo ki Figura 1, e duj kompleksura si len trin sub-unitetura RC (RC-L, RC-M thaj RC-H) phangle e LH1 antenasa. I 2.80-A struktura e kompleksosqi bi protein-W sikavel 16 αβ heterodimerura, so keren jekh phandlo LH1 śerutno pherdo krujal o RC, maj dur akhardo sar RC-LH116 komplekso. I 2.65Å struktura e kompleksosqi savi si la proteina-W si la jekh 14-heterodimero LH1 phandlo katar o proteino-W, maj dur akhardo sar RC-LH114-W.
(A thaj B) Reprezentàcia e śeresqi e komponentosqi. (C thaj D) Pigmentura phangle sikavde ande śtange. (E thaj F) E kompleksura dikhline katar e citoplazmatikani rig si len peptidura thaj LH1 subunitetura reprezentirime ande karikatura, thaj si numerime katar o protein-W gap [konzistento e Rba numerime. sphaeroides complex (13)]. Palal o LH1-α, o rang e proteinosqo si lole; vaś LH1-β, o rang e proteinosqo si lole; vaś o proteino-W, o proteino si lole; vaś o RC-H, si cyan; vaś o RC-L, si Naranźo; vaś RC-M, magenta. E kofaktora si reprezentirime katar e śtange, o zeleno reprezentisarel e molekule BChl thaj BPh a, o lila reprezentisarel e karotenoidura, thaj o lole reprezentisarel e molekule UQ10. (G thaj H) Barjardo dikhipe e protein-W gap-esko ano ekvivalentno regiono e RC-LH114-W kompleksosko (G) thaj RC-LH116 komplekso (H). E kofaktora si sikavde ano formiribe e thanesko pherdipe, o chelated quinone si sikavdo ano lole. O protein-W gap si sikavdo kotar jekh lole ćorri linia ko (G), thaj e cikne thana kote so o quinone/quinolol difuzirinel pe ko LH116 ringo si sikavdo kotar jekh kalo ćorri linia ko (H).
I figura 1 (A thaj B) sikavel o RC phanglo putarde vaj phandade aransura LH1αβ heterodimerencar, savi phandel duj BChl thaj jekh karotenoido (Figura 1, C thaj D). E anglune studie sikade kaj o Rps si o LH1 komplekso. Ano biosintetikano drom e spirulina xanthin, akala specije isi len miksarde populacie e karotenoidencar (17). Numaj, o spiropyrroxanthin si o dominantno karotenoido thaj lesko densiteto si satisfàkciaqo. Anda kodo, alosardam te modelisaras o spiroxanthin pe sa le LH1 phanglimaske thana. E alfa thaj beta polipeptidura si jekhutne TMHs save si len skurto membranake avrune regionura (Figura 1, A, B, E, thaj F). Vi te na sas dikhlini i densitàta 17 rezìduurenqi anθ-o C-terminus, o alfa polipeptido sas ćhindo katar o Met1 źi k-o Ala46 anθ-e duj kompleksură. β polipeptido sas redukime katar Gly4 źi ka Tyr52 anθ-o RC-LH116, thaj katar Ser5 źi ka Tyr52 anθ-o RC-LH114-W. Na sas dikhlino densiteto 3 vaj 4 N-terminalne vaj 13 C-terminalne reziduengo (Figura S1). I analìza e spektrometriaqi e masesqi e miksarde RC-LH1 kompleksosqi kerdini katar o śukar-tipo sikavdăs ke o xasardo than sas o rezultàto katar o heterologo ćhivipen kadale peptidurenqo (Figura S1 thaj S2). I N-terminalno formilacia e α-Met1 sas vi dikhlini (f). I analìza sikavdăs ke o α-peptido si kerdo katar e rezìduură fMet1 źi k-o Asp42/Ala46/Ala47/Ala50, thaj o β-peptido si kerdo katar e rezìduură Ser2 źi k-i Ala53, so si anθ-o laćho agoripen e tikne temperaturaqe EM densitàtaqe mapaça.
I koordinàcia e α-His29 thaj β-His36 kerel e BChls te dikhen anglal; sako αβ heterodimero ćhivel pes pesqe paśutnença te kerel jekh putardo śerutno (RC-LH114-W) vaj jekh phandlo śerutno (RC-LH116) krujal o RC O excitono phanglo pigmentosqo array (Figura 1, C thaj D). Komparaciasa e 877 nm band e RC-LH114-W, o 880 nm absorpciako lole paruvipe e RC-LH116 si 3 nm (Figura 2A). Numaj, o spektro e cirkularno dikroizmosqo si paśe sa kodo (Figura 2B), so sikavel ke vi te si jekh klaro diferènca maśkar putarde thaj phandade śerutne, o lokalo ambiènto e BChls-esqo si but sar jekh. O absorpciako lole ćhivipen śaj te avel o rezultàto katar o redukime termàlo phiripen thaj o vazdipen e stabilitetosqo anθ-o phandlo śerutno (18, 19), o paruvipen anθ-o pigmentosqo phanglipe kerdo katar o phandlo śerutno (20, 21), vaj jekh kombinàcia kadale duje efekturenqi (11).
(A) Ultravioleto/dikhlino/paśe-infra-ruźo absorpciaqo spektro, savesqe śere si markisarde lenqe korespondentne pigmenturenqe thaj normalizirime ko BPh śero ko 775 nm. (B) Spektro e cirkularno dikroizmosko normalizirime ki BChl absorbàcia ko 805 nm. (C thaj D) Alosarde ΔA spektrura katar e vrama-resle absorpciake spektrura katar o RC-LH114-W komplekso (C) thaj RC-LH116 komplekso (D). Te ovel maj laćhi komparacia, sa e spektrura si normalizirime ko ∆A kotar −A ko 0.2 ps. (E) I śajutnipen e oxidaciaqo e citokromosqo c2 palal i irradiacia anθ-i prezènca e verver koncentràcienqi e UQ2 (dikh i Figura S8 vaś e śukar dàte). (F) Ande ćhelura barjarde telal tikni, maśkaruni vaj bari intenzitèta e śukaripnaski (10, 30 vaj 300μMm-2 s-1, respektivno), o proteino W thaj RC-L subunitètură anθ-o purifikuime komplekso thaj o raporto e membranenqo ćhivdo. Determinisaren o nivelo e proteinengo katar SDS-poliakrilamidno gel elektroforeza thaj imunoanaliza (dikh o Figuro S9 vash e suro data). Determinisaren o raporto ande relacia e purifikuime RC-LH114-W kompleksosa. O stehiometrikano raporto RC-L thaj proteino-W e kompleksosko si 1:1.
E BChls ki pozicia 1 ki deformirimi αβ14 cirkulacia e RC-LH114-W (Figura 1, A, C, thaj E) si maj pashe e RC primarno donatoreske (P) 6.8Å kotar e ekvivalentno BChls ki RC-LH116 (Figura 1, B, D, thaj F, thaj S3); numaj, e tranzitorno absorpciaki kinetika e duje kompleksenqi sikavel kaj vaś RC-LH114-W thaj RC-LH116, e excitaciaqe energiaqe transferosqe vràmaqe konstante katar LH1 źi k-o RC si 40 ±4 thaj 44±3 ps (Figura 2). , C thaj D, Figura S4 thaj Tabela S2). Naj vi signifikantno diferènca anθ-o elektronikano transfero anθ-o RC (Figura S5 thaj relaciaqo suplementàro tèksto). Amen suspektisaras kaj i paśutni korrespondènca e vràmaqi vaś o transfero e enèrgiaqo maśkar o LH1 thaj o RC-P si kerdini katar i sasti distanca, o angluno thaj i potenciàlo enèrgia e maj bute BChl-esqi anθ-e duj LH1 śerutne. Dikhel pes kaj o rodipe e LH1 energiako modelo te resel pes i minimalno distanca na si maj sigo sar o direktno transfero e energiako katar e suboptimalne thana ko RC. O putardo LH1 ćàso anθ-o RC-LH114-W śaj te nakhel vi jekh bi-importànto termàlo phiripen anθ-e kondicie e tikne temperaturaqe vaś i strukturàlo analìza, thaj si jekh maj lungo αβ14 ćàso konformàcia anθ-i sobaqi temperatura katar i pigmentàciaqi distanca e βBChls anθ-i pozicia e RC 1.
O RC-LH116 komplekso si les 32 BChls thaj 16 karotenoidura, thaj lesko sasto aranźmanto si sa kodo sar kodo so si lino katar o Thermochromatium (Tch.) pidpidum [Protein Data Bank (PDB) ID 5Y5S] (9), Thiorhodovibrio (Trv.) DB strain (IDC 797) PDR (297) thaj zeleno alge (Blc.viridis) (PDB ID 6ET5) (10). Palal o alineàcia, numaj tikne deviàcie anθ-e pozicie e αβ heterodimerenqe sas dikhline, maj but 1-5, 15, thaj 16 (Figura S6). I prezènca e proteinosqi-W si la jekh baro impakto p-i struktura e LH1-esqi. Lesqe trin TMH si phangle tikne śerutnença, e N-terminalosa pe lumen rig e kompleksosqi thaj o C-terminalo pe citoplazmaqi rig (Figure 1A thaj 3, A źi ka D). O proteino-W si buteder hidrofobno (Figura 3B), thaj TMH2 thaj TMH3 keren interakcija e LH1αβ-14-esa te keren jekh transmembranaki rig (Figura 3, B thaj E dži ko G). O interfejso si kerdo maj but katar Phe, Leu thaj Val rezìdue anθ-i transmembràno rig. Kadala reziduura si pherde hidrofobno aminoacidencar thaj αβ-14 pigmentencar. Nesave polarne reziduura vi von den kontribucia ki interakcija, inkluzivno o hidrogenosko phanglipe maškar o W-Thr68 thaj o β-Trp42 pe o than e kompleksno kavitetosko (Figura 3, F thaj G). Pe o than e citoplazmaqo, o Gln34 si paśal i keto grupa e αβ-14 karotenoidenqi. Paše odova, i n-dodecyl β-d-maltoside (β-DDM) molekula sas resli, thaj lako hidrofobno šero resljarda pes ko interfejso maškar o proteino-W thaj αβ-14, thaj o lipidno šero šaj te ovel arakhlo ko trupo. Amen vi dikhlam kaj e C-terminalno rezoluciake regionura e proteineske W thaj RCH si but paše, numaj na andar o spektro te keren specifična interakcie (Figura 1, A thaj E). Numaj, śaj te aven interakcie anθ-e na-resle C-terminalne aminoàcidură kadale duje proteinurenqe, save śaj te den jekh mekanìzmo vaś i rekrutàcia e proteinenqi-W anθ-o vaxt e khetanipnasqo e RC-LH114-W kompleksosqo.
(A) O proteino-W, savo si anglal o interfàso e LH1αβ14-eça anθ-i fòrma e karikaturenqi, si les jekh śerutno śerutno śerutno (lolo), sikavdo anθ-jekh kotor e elektrostatikane potenciàlosqo diagramosqo (transparentno lole rig e konturǎqo nivelo 0,13). (B) Protein-W reprezentirime katar jekh hidrofobno kolorime rig. E polarno thaj charged thana si sikavde ano cyan, e hidrofobno thana si sikavde ano parno, thaj e zurales hidrofobno thana si sikavde ano oranžo. (C thaj D) Proteina-W reprezentisardo an-o karikatura, lesqi orientàcia si sa kadja sar an-o (A) (C), thaj si ćhivdi 180° (D). Palal i pozicia anθ-i sekvenca, e distinkciaqe reziduură len jekh śema e rangăqi, kaj o N-terminalo si lole thaj o C-terminalo si lole. (E) Protein-W anθ-o sa kodo dikhipen sar anθ-o (A), thaj e reziduură anθ-o interfejso e proteinosqo-W:LH1 si reprezentisarde kaθar śtange save si len phangle marke. (F) O proteino-W si pherdo 90° ande relacia e (E) thaj LH1αβ14 ande reprezentacia e karikaturaki, thaj ande relacia e reziduenca e interfejsesqe ande reprezentacia e bar. E reziduura save si opral katar o beta polipeptido si markirime. O kofaktor si sikavdo sar jekh bar savo malavel pes e koloresa e Figura 1, o dekompozime β-DDM si sikavdo ko lole, thaj o oksigeno si sikavdo ko lole. (G) O dikhipen anθ-o (F) si ćhudino 180°, e prominentne reziduenθar e alfa polipeptidosqo etiketirime.
O proteino-W ćhivel o than e αβ heterodimerosqo (o 15-to anθ-i Figura 1F), kadja ke na phandel pes o ćàso thaj te ćhivel pes o angluno trin αβ heterodimèrură. Dikhlilo sas kaj o maj baro inklinaciako angluno αβ-1 heterodimero ande relacia e filmoske normalno sas 25° dži ko 29° (Figura 1, A thaj E), savo sas kerdo katar o 2° dži ko 8° inklinacia e αβ-1 ande RC A zuralo kontrasto-LH116 (Figura 1, B thaj F). O dujto thaj o trinto heterodimeri si phangle 12° ji ko 22° thaj 5° ji ko 10°, respektivno. Palal o sterikano phanglipe e RC-esqo, o ćhivipen e αβ-1-esqo na inkludil o dujto parno αβ (so korespondil e 16-to αβ-esqe anθ-i Figura 1F), kadja ke kerel jekh klaro ćàso anθ-o LH1-esqo ringo (Figura 1, A thaj E) . Palal o bi-aśtipen duje αβ heterodimerenqo, akomodime katar o xasaripen śtar BChl thaj duje karotenoidurenqo, ni jekh katar e karotenoidura na phandel pes e ćorre αβ-1 subunitença, so kerel jekh LH114-W ringo savo si les 13 karotenoidura Vegetarian thaj 28 BChls. E lokalno rezoluciake estimacie e duje kompleksurenqe anθ-e αβ1 źi ka 7 regionură si maj tikne sar kodola anθar o aver kotor e LH1 śerutnesqo, so śaj te sikavel i inherentno plasticitàta e LH1 subunitenqi paśal o than RC QB (Figura 4) .
E patretura katar RC-LH114-W (A thaj B) thaj RC-LH116 (C thaj D) si sikavde katar o sasto dikhipe opral/rig dikhipe (A thaj B) (A thaj C) thaj katar e kavitetoski rig katar o Fig. 1. (B thaj D). Le kolorime chave si sikavde pe chachi rig.
O jekhto aver karakteristikano kerdo komplekso savo si les jekh stehiometrikano raporto 1:14 si o Rhodococcus sphaeroides (Rba.) RC-LH1-PufX dimer (13). Numaj, o proteino W thaj o PufX naj len obviousno homologia, thaj si len jekh signifikantno impakto pe lenge respektivne LH1 strukture. PufX si jekh TMH e N-terminalo citoplazmatikane domenosa savo kerel interakcija e citoplazmatikane rigasa e RC-H subunitetosko (13) ki pozicia savi maladjol e Rps-esa. palustris LH116αβ-16. O PufX kerel jekh kanalo vaś o paruvipen e kinone/kinolone maśkar o RC-LH1 thaj o komplekso bcl citokromo thaj si prezento anθ-e sa e Rba. sphaeroides core complex (13). Vi te si o interfejso monomero-monomero ano Rba. O sphaeroides RC-LH1-PufX dimero si phanglo ki pozicia e phanglimaski e proteinaki W ki RC-LH114-W, thaj o gap kerdo kotar o PufX thaj o proteino-W si ki jekh ekvivalentno pozicia (Figura S7A). O gap ano RC-LH114-W si vi phanglo e hipotetikane kinoneske kanalesa (8) e Pseudomonas rosea LH1, savo si kerdo katar peptidura save naj phangle e proteinasa W vaj PufX (Figura S7B). Paše odova, o kanalo e kinonesqo anθ-o Blc. O smaragdo zeleno LH1 kerdo kana na mukhel pes jekh γ subunit (7) si phanglo ki jekh pozicia (Figura S7C). Vi te si mediirime katar diferentne proteine, o sikavipe kadale kinonengo/kinolol kanalengo ande jekh khetani pozicia ando RC-LH1 komplekso dikhel pes sar egzamplo vash konvergento evolucia, so sikavel ke o gap kerdo katar o proteino W shaj te kerel buti sar kinonosko kanalo.
O pharipe ano LH114-W ćàso del śajsaripen te kerel pes jekh kontinuo membranaqi rig maśkar o andruno than e RC-LH114-W kompleksosqo thaj i bari membrana (Figura 1G), na te phandel pes e duj domenură anθ-o jekh proteinosqo por sar anθ-e proteinură. O RC-LH116 komplekso si sar jekh phandlo Tch. Komplekso sar e suja (22) (Figura 1H). Sar so i difuzia e kinonesqi anθ-i membrana si maj sigo sar i difuzia anθ-o tikno proteinosqo kanàlo, o putardo LH114-W ćàso śaj te del maj sigo RC-esqo pherdo sar o phandlo LH116 ćàso, thaj i difuzia e kinonesqi anθ-o RC śaj te avel maj limitirime. Te śaj te testisaras te si ke o proteino W afektil i konverzia le kinonenqi prekal o RC, kerdăm jekh testò e oxidaciaqo e citokromosqo pe jekh koncentràcia e ubikinonesqi 2 (UQ2) (jekh analogo e naturalone UQ10-esqo saves si les jekh maj skurto izopreno śero) (Figura 2E). Vi te si ke i prezènca e chelàto kinonesqi ćhinavel i ćaćutni determinàcia e dikhipnaski Michaelis konstanta (RC-LH114-W thaj RC-LH116 si laćhe vaś 0.2±0.1μM thaj 0.5±0.2μM, respektiv), i maj bari ràta e RC-LH114-W ( 4.6±0.21-2) si s-e-1. 28±5% maj baro sar RC-LH116 (3.6±0.1 e-RC-1 s-1).
Amen anglunes gindisardam kaj o proteino-W si prezento ko 10% kotar o komplekso (16); kathe, e okupaciake rate e tikne-lumjake, maśkar-lumjake thaj bare-lumjake barvalipnaske ćhelurenqe si 15±0.6%, 11±1% thaj 0.9±0.5, respektivno % (Figura 2F). I kvantitativno komparacia e maseske spektrometriaki sikavda kaj o thovipe e histidine tag-esko na redukisarda o relativo butipe e protein-W-esko ande relacia e dživdine-tipeske shtammencar (P = 0.59), odolesqe kadala nivelura na si artefakto e modifikuime protein-W-esko (Figura S10). Numaj, kadi tikni okupacia e protein-W-esqi anθ-o RC-LH1 komplekso śaj te del śajsaripen varesave RC-enqe te ćhiven pen anθ-i jekh akceleràciaqi rèta, kadja te tiknjarel pes o maj tikno paruvipen e quinone/quinolone anθ-o RC-LH116 komplekso. Amen dikhlam kaj o baro nivelo e okupaciako e lumiako si inkonsistente e neve transkriptomikane datenca, so sikavel kaj e pufW genengi ekspresia vazdel pes telal zurali lumia (Figura S11) (23). I diferènca maśkar i pufW transkripcia thaj i proteina-W inkorporàcia anθ-o RC-LH1 komplekso si konfuzno thaj śaj te sikavel i komplekso regulacia e proteinosqi.
Ano RC-LH114-W, 6 kardiolipin (CDL), 7 fosfatidilkolin (POPC), 1 fosfatidilglicerol (POPG) thaj 29 β-DDM molekule si alosarde thaj modelirime ande lende 6 CDL, 24 POPC, 2 POPG thaj 12 DMD. RC-LH116 (Figura 5, A thaj B). Ande kadala duj strukture, o CDL si pashe pe citoplazmatikani rig e kompleksoski, kana o POPC, POPG thaj β-DDM si maj but pe luminalno rig. Duj lipidno thaj detergentno molekule sas izolime ano αβ-1 dži ko αβ-6 regiono e RC-LH114-W kompleksosko (Figura 5A), thaj pandž sas izolime ano ekvivalentno regiono e RC-LH116 (Figura 5B ). Maj but lipidura sas arakhline pe aver rig e kompleksoski, maj but CDL, akumulime maškar RC thaj αβ-7 dži ko αβ-13 (Figura 5, A thaj B). Aver strukturalno resolvirime lipidura thaj detergentura si phangle avrial o LH1 ringo, thaj lačhe resolvirime acil lancura si phangle maškar e LH1 subunitetura, tentativno dezignirime sar β-DDM ande RC-LH114-W, thaj definime sar β-DDM ande RC A mikstura β-DDM thaj PO-LH16-LH16. E similarno pozicie e chelating lipidenqe thaj e deterzenturenqe anθ-i amari struktura sikaven kaj von si fiziolośikane relevantne thana vaś phanglipe (Figura S12A). E pozicie e ekvivalentno molekulenge ando Tch si len vi laćhi konzistènca. Laćho thaj Trv. O shtampo 970 RC-LH1s (Figura S12, B źi ka E) (9, 12) thaj e hidrogeno-phanglimaske reziduură katar o lipidno śerutno grupa sikade dosta laćhi konzervàcia anθ-o sekvencaqo phanglipe (Figura S13), so sikavel ke o Konservisardo CDL savo phandel pes k-o RC (24), kadala thana śaj te aven konservisarde anθ-o komplekso RCH-LH1.
(A thaj B) RC-LH114-W (A) thaj RC-LH116 (B) peptidura si reprezentirime kotar e karikature, thaj e pigmentura si reprezentirime kotar e štange, kotar o kolori kotar e Figura 1. E lipidura si sikavde ko lole, thaj e detergentura si sikavde ko lole. UQ phanglo e RC QA thaj QB thana si lole, a izolirime UQ si lole. (C thaj D) Sa kodola dikhimata sar (A) thaj (B), bi lipidenqo. (E ji ko G) Baro dikhipe e Q1(E), Q2(F) thaj Q3(G) kotar o RC-LH116, e rigate lancura save kerena efekto jekh avres. E hidrogenoske phanglipa si sikavde sar kale ćorre linie.
Ano RC-LH116, vi o RC QA thaj o QB UQ, save len kotor ano transfero e elektronengo ano proceso e separaciako e chargengo, si dekompozime ano olengere phanglimaske thana. Numaj, anθ-o RC-LH114-W, o QB kinono na sas reslo thaj ka avel diskutime maj tele. Po dur katar e QA thaj QB kinone, duj chelate UQ molekule (so si maškar o RC thaj LH1 ringura) si alosarde ande RC-LH114-W struktura palal lenge lačhe resolvirime šerutne grupe (so si ande Q1 thaj Q2, respektivno). than). Figura 5C). Duj izoprene jekhimata si dino ko Q1, thaj i mapa e densitetosko resolvirinel e 10 izoprene riga ko Q2. Ki struktura e RC-LH116, trin chelate UQ10 molekule (Q1 źi ka Q3, Figura 5D) sas resolvirime, thaj sa e molekule si len jekh klaro densitàta anθ-o sasto śero (Figura 5, D źi ka G). Ande duj strukture, e pozicie e kinone šerutne grupengo Q1 thaj Q2 si len laćhi konzistènca (Figura S12F), thaj von keren interakcija numaj e RC-eça. O Q1 si phanglo ko vudar e W gap-esko RC-LH114-W (Figura 1G thaj 5, C, D thaj E), thaj o Q2 si paše o than e phanglimasko e QB-esko (Figura 5, C, D) thaj F). E garavde L-Trp143 thaj L-Trp269 rezìdue si but paśe e Q1 thaj Q2 thaj den potenciàlo π-stacking interakcie (Figura 5, E thaj F, thaj Figura S12). L-Gln88, 3.0 Å katar o distalno oksigeno katar o Q1, del jekh zuralo hidrogenosko phanglipe (Figura 5E); akava rezìduo si garavdo anθ-e sa e RC-ură numaj anθ-i maj dur relacia (Figura S13). L-Ser91 si konservativno substituime vash o Thr ano maj but aver RC (Figura S13), si 3.8 Angstroms kotar o metil oksigeno kotar o Q1, thaj shaj te del slabo hidrogenoske phanglipe (Figura 5E). O Q3 na dikhel pes te avel les jekh specifiko interakcija, numaj si phanglo ki hidrofobno rig maškar o RC-M subunit thaj o LH1-α subunit 5 dži ko 6 (Figura 5, D thaj G). Q1, Q2 thaj Q3 vaj paśe chelate kinone sas vi von resolvirime anθ-o Tch. Laćho, Trv. Strain 970 thaj Blc. I irisqi struktura (9, 10, 12) sikavel jekh garavdo than e phanglimasko e kinonesqo anθ-o RC-LH1 komplekso (Figura S12G). E pandž dekompozime UQ-a anθ-o RC-LH116 si anθ-o laćho agor e 5.8±0.7 anθar svako komplekso determinisardo kaθar i kromatografia e likvidosqi (HPLC), kana e trin dekompozime UQ anθ-o RC-LH114-W si maj tikne sar O mesurime gin e 6.2±0.3 (Fig. S14) sikavel ke na si resle e molekule UQ-ură and-o UQ. struktùra.
E pseudo-simetrikane L thaj M polipeptidura sako jekh si len pandž TMH thaj keren jekh heterodimero savo kombiniril jekh BChl dimero, duj BChl monomerura, duj bakteriofagoske (BPh) monomerura, thaj jekh na-Heme fero thaj jekh vaj duj UQ10 molekule. Prekal o than e hidrogenoske phanglimasko pe terminalno ketonoski grupa thaj lesko pindžardo akumulàcia anθ-e Rps, e karotenoidura si inkorporime anθ-i M-subunìta, savi si akhardi cis-3,4-dehydroorhodopin. Specija (25). O avruno membranako domeni e RC-H-esko si phandlo ki membrana kotar jekh TMH. I sasti RC struktura si sar e trin subunitetura RC e phangle specijengo (sar Rba). sphaeroides (PDB ID: 3I4D). E makrocikli e BChl thaj e BPh, o karotenoidno rig thaj o na-heme fero si preklopime andar o rezoluciako rango kadale strukturengo, sar vi e UQ10 sherutni grupa ko QA than thaj o QB kinono ko RC-LH116 (Figura S15).
I disponibilitèta duje RC strukturenqi save si len diferentne QB thanesqe okupàciaqe rate del jekh nevi śansa te dikhel pes e konzistènto konformàciaqe paruvimata save aven e QB kinone phanglimatenθar. Ano RC-LH116 komplekso, o QB kinono si phanglo ki pherdo phangli “proksimalno” pozicia (26), numaj i separacia e RC-LH114-W nane la QB kinona. Naj QB kinono ano RC-LH114-W, so si surpriza soske o komplekso si aktivno, maj but kotar o RC-LH116 komplekso e strukturalno resolvirime QB kinonosa. Vi te si ke le duj LH1 ringura chelatin karing śov quinonura, panź si strukturalno resle ando phandlo RC-LH116 ringo, kana numaj trin si strukturalno limitirime ando putardo RC-LH114-W ringo. Akava vazdipe e strukturalno nasvalimasko shaj te sikavel o maj sigo paruvipe e RC-LH114-W QB thana, maj sigo kinone kinetika ano komplekso, thaj maj bari shaipe te nakhel pes o LH1 loop. Amen sugestisaras kaj o bi-UQ ano RC QB than e RC-LH114-W šaj te ovel o rezultato kotar jekh maj kompleksno thaj maj aktivno komplekso, thaj o QB than e RC-LH114-W sine sigo phandlo ano UQ turnover O specifično stadiumo (o ulavipe ko QB than sine phandlo) sikavel i konformàcia kadale aktivitetosqi.
Bizo QB, i rotacia e L-Phe217-esqi savi avel anθ-i jekh pozicia savi si inkompatibilno e UQ10-esqe phanglimaça, sosqe ka kerel jekh thanutni kolìzia e anglune izoprene jekhimatenqe e śeresqi (Figura 6A). Paše odova, e obviousno majbare konformaciaqe paruvimata si obviousno, maj but o helix de (skurto helix anθ-o ćàso maśkar TMH D thaj E) kaj o L-Phe217 si ćhudino anθ-o QB phanglimasko ćàso thaj i rotacia e L-Tyr223 (Figura 6A ) Te phagel pes o phanglipe e hidrogènosqo e M-Ap45-esqe thaj te phandel pes o agor e phanglimasko QB than (Figura 6B). O Helix de pivotil pe peski baza, o Cα e L-Ser209-esko si ćhudino 0.33Å, kana o L-Val221Cα si ćhudino 3.52Å. Naj dikhline paruvimata ko TMH D thaj E, save si superimpozime ko duj strukture (Figura 6A). Sar so źanas, kadaja si i angluni struktura anθ-o naturalo RC savi phandel o than QB. Jekh komparacia e kompletno (QB-phangle) strukturasa sikavel kaj anglal o kinono te ovel redukime, trubul jekh konformaciako paruvipe te kerel pes te del pes andre ko kinono. L-Phe217 rodel te kerel jekh π-stacking interakcija e kinoneske šerutne grupasa, thaj i heliksa ćhivel pes avri, so del śajsaripen e skeletosqe L-Gly222 thaj e rig e L-Tyr223 te keren jekh hidrogenosqi phanglimasko netvorko e stabilno hidrogenosqe phanglimasko strukturasa (Figura 6, A thaj C).
(A) O karikatura pherdo hologramosqi (L lanco, oranźo/M lanco, magenta) thaj apo (śukar) struktura, anθ-i savi e ključne reziduură si sikavde anθ-i fòrma e reprezentàciaqi sar jekh śtango. UQ10 si reprezentirime kotar jekh lole bar. I punktirime linia sikavel e hidrogenoske phanglipe kerdo ki sasti struktura. (B thaj C) I reprezentàcia e apolipoproteinosqi thaj i sasti ringosqi struktura, sikavindoj o oksigeno e rigăqo e L-Phe217 anθ-o lole thaj o L-Tyr223 anθ-o lole, respektiv. I subunitèta L si portokalo; le M thaj H subunitetura naj kolorime. (D thaj E) Apolipoprotein (D) thaj sasto (E) RC QB thana [koloro katar (A) respektivno] thaj Thermophilus thermophilus PSII (zeleno, lole e plastikane quinonosa; PDB ID: 3WU2) Align (58).
Bi-aźukerdo, vi te si but strukture e QB-deficitno RC-enqe bi LH1-esqe, e konformaciaqe paruvimata dikhline anθ-i kadaja studia na sas maj anglal raportisarde. Kathe si andre i QB-esqi depleciaqi struktura katar o Blc. viridis (PDB ID: 3PRC) (27), Tch. tepidum (PDB ID: 1EYS) (28) thaj Rba. sphaeroides (PDB ID: 1OGV) (29), sa save si pashe sa kodola sar lengi sasti QB struktura. Paśutni inspekcia e 3PRC-esqi sikavdăs ke e LDAO (Lauryl Dimethyl Amine Oxide) detergentosqe molekule phanden pen anθ-o vudar e QB poziciaqo, so śaj te kerel te na avel rearanźisardo anθ-i jekh phandli konformàcia. Vi te o LDAO na dekompozisarel pes anθ-i savi pozicia anθ-o 1EYS vaj anθ-o 1OGV, kadala RCs si kerde anθ-o sa kodo detergento thaj odolesqe śaj te keren o sa kodo efekto. I kristaloski struktura e Rba. Sphaeroides RC ko-kristalizirime e citochrome c2 (PDB ID: 1L9B) vi dikhel pes te avel les jekh phandlo QB than. Numaj, anθ-o kadava lil, i N-terminalo rig e RC-M polipeptidosqi (so kerel interakcia e QB phanglimaske thanaça prekal o H phanglipe e Tyr rezìduosqo anθ-i Q heliksa) lel jekh na-naturalno konformàcia, thaj o QB konformàciaqo paruvipen na si maj dur xramosardo (30 ). So si sigurime si kaj amen na dikhlam kadi vrjama deformacia e M polipeptidoski ki RC-LH114-W struktura, savi si pashe sa jekh sar o N-terminalno regiono e RC-LH116 RC. Trubul vi te ovel ramosardo kaj palo xasaripe e LH1 antenako bazirime pe detergento, e apolipoprotein RCs ko PDB sine resolvirime, so eliminirinela o andrune kinone thana thaj lipidura ko gap maškar o RC thaj o andruno than e LH1 ringosko (31, 32). RC ačhel funkcionalno soske vov arakhel sa e kofaktora, numaj o dekompozibilo QB kinono, savo si maj tikno stabilno thaj butivar xasarel pes ano proceso e preparaciako (33). Paše odova, si pinʒardo kaj o ćhivipen e LH1 thaj e naturalne ciklikane lipidenqo katar o RC śaj te avel les jekh impakto p-e funkcie, sar so si o skurto źivdipen e charge-separated P+QB-statosqo (31, 34, 35). Anda kodo, ame spekulisaras ke i egzistenca le lokalno LH1 ringosqi savi si paśal o RC śaj te inkrel o “phandle” QB than, kadja te arakhel pes o lokalo ambiènto paśal o QB.
Vi te o apolipoprotein (bi QB kinono) thaj i kompletno struktura reprezentisaren numaj duj snapshotura katar o paruvipen e QB thanesko, na jekh serija evenimenturenqi, si indikàcie kaj o phanglipe śaj te avel phandlo te na avel o phanglipe pale katar o hidrokinono Te inhibiril pes i inhibicia e substratosqi. I interakcija maśkar o quinolol thaj o quinon paśal o QB than e apolipoproteinosqo śaj te avel aver, so kerel lesqo nakhavipen katar o RC. But vrama sas propozime kaj e konformaciake paruvimata khelen rola ano phanglipe thaj redukcia e kinonengi. I śajmata e ćhivde RC-enqi te redukisarel e kinonură palal i ćorri adaptàcia si ćorri (36); I X-ray kristalografia sikavel kaj akava nasvalipe si kerdo kotar o QB kinone so si phanle ki “distalno” konformacia kotar 4.5 Å kotar e aktivno proksimalno pozicia (26) , 37). Amen sugestisaras kaj kadi distalno phanglimaski konformacia si jekh snapshot e maśkarthemutne stàtosqo maśkar o apolipoprotein thaj i pherdo ringosqi struktura, savi źal palal i angluni interakcia e kinoneça thaj o putaripen e QB thanesqo.
O tipo II RC arakhlo ando PSII komplekso katar varesave fototrofikane bakterie thaj cianobakterije, alge thaj kashta si les strukturalno thaj funkcionalno konzervacia (38). I strukturàlo rigăripen sikavdo anθ-i Figura 6 (D thaj E) sikavel i similaritèta maśkar e PSII RCs thaj o QB than e bakteriàlo RC kompleksosqo. Kadi komparacia sas but vrama modelo vash te studirinel pes o pashe phanglo sistemo vash o phanglipe thaj redukcia e kinoneski. E anglune publikàcie sikade kaj e konformaciaqe paruvimata si akomodime katar e PSII redukcia e kinonenqi (39, 40). Anda kodo, kana dikhel pes i evoluciaqi konzervàcia e RC-esqi, kadava maj anglal na dikhlino phanglimasqo mekanìzmo śaj te avel vi aplikàbilo k-o QB than e PSII RC-esqo anθ-e oksigenime fototrofikane śajutne.
Rps ΔpufW (bi-etiketirime pufW delecia) thaj PufW-His (C-terminalno 10x His-tagged protein-W ekspirime katar o naturalno pufW lokuso) shtammura. palustris CGA009 sas deskripto ande amari angluni buti (16). Kadala shtammura thaj o izogenikano ćororo-tipo dad sas arakhline katar o frižider kana sas ćhivdo jekh tikno gin e ćhelurenqo pe PYE (sako 5 g litro -1) (garavde anθ-o LB k-o -80 °C, ande savo sas 50% ( w/v) glicerol) proteina, ekstrakto e droźdenqo thaj succinato) agar [1.5%/v) plato. I platina sas inkubirime sasti raći ano tunyariko ki temperatura e sobake ano anaerobno kondicie, thaj palo odova sas lumjardi e parne lumiasa (~50 μmolm-2 s-1) dini kotar e OSRAM 116-W halogen lampa (RS Components, UK) 3 dži ko 5 divesa dji kana sikavdilo jekh kolonia. Jekh kolonia sas kerdini te inokulisarel 10 ml M22+ mediumo (41) pherdo 0.1% (w/v) casamino acidosa (maj dur akhardo sar M22). I kultura sas barjardi anθ-e kondicie tikne oksigenosqe anθ-o tuniariko anθ-o 34°C ćorripen anθ-o 180 rpm vaś 48 òre, thaj palal kodoja 70 ml e kultura sas inokulime anθ-e sa kodola kondicie vaś 24 òre. Jekh semi-aerobno kultura e volumosa 1 ml si kerdini te inokulinel 30 ml M22 mediumo ande jekh 30 ml universalno śuruvno transparentno stakloski botela thaj irradime e agitaciasa (~50μmolm-2 s-1) 48 ćàsura e sterilno magnetikane zorasa Stirring rod. Palal kodoja 30 ml e kulturaqe sas inokulisarde karing 1 litro kultura anθ-e sa kodola kondicie, savi sas palal kodoja utilizisardi te inokulisarel pes karing 9 litrura kultura iluminime k-o ~200 μmolm-2 s-1 vaś 72 òre. E ćhelura sas kidine katar e centrifugàcia ko 7132 RCF vaś 30 minutură, resuspendime anθ-e ~10 ml 20 mM tris-HCl (pH 8.0), thaj garavde anθ-o -20°C źi kana sas trubujipe.
Palal o ćhivipen, thoven nesave kristalura deoksiribonukleaza I (Merck, UK), lizozimo (Merck, UK) thaj duj Roche holoenzyme protease inhibitor tablete (Merck, UK) ande resuspendime ćhelura. Ande jekh 20,000 psi francuzikani presiaki ćhelja (Aminco, USA), e ćhelura sas phagerde 8 źi ka 12 drom. Palal o ćhivipen e na-phagerde ćhelurenqo thaj e na-solubilne ćhelurenqo katar i centrifugàcia k-i 18,500 RCF vaś 15 minutură k-i 4°C, i membrana sas ćhudini katar o pigmentime lizato katar i centrifugàcia k-i 113,000 RCF vaś 2 òre k-i 43,000°C. Te ćhivel pes i solubilno frakcia thaj te ćhivel pes pale i kolorime membrana anθ-e 100 źi ka 200 ml 20 mM tris-HCl (pH 8.0) thaj te homogenizisarel pes źi kana na si dikhline agregatură. I suspendime membrana sas inkubirime anθ-o 20 mM tris-HCl (pH 8.0) (Anatrace, USA) anθ-o 2% (w/v) β-DDM vaś 1 ćàso anθ-o tuniariko anθ-o 4°C anθ-o tikno ćhivipen. Palal kodoja, centrifugisarel pes k-i 70°C te ćhivel pes 150,000 RCF k-i 4°C vaś 1 ćàso te ćhivel pes o reslo na-xramosardo.
I solubilizirime membrana katar o ΔpufW strain sas thodini pe 50 ml DEAE Sepharose ion exchange kolona trin kolonenge volume (CV) e phanglimasko buferi [20 mM tris-HCl (pH 8.0) so si 0.03% (w / v) β-DDM]. Thov e kolona duje CV phanglimaske buferenca, thaj palal kodoja thov e kolona duje phanglimaske buferenca save si len 50 mM NaCl. O RC-LH116 komplekso sas eluime e linearno gradientosa 150 źi ka 300 mM NaCl (anθ-o phanglimasko buferi) pe 1.75 CV, thaj o aver phanglimasko komplekso sas eluime e phanglimasko buferosa savo sas les 300 mM NaCl pe 0.5 CV. Kiden o spektro e absorpciaqo maśkar 250 thaj 1000 nm, ćhiven i frakcia savi si la absorpciaqo raporto (A880/A280) maj bari sar 1 ko 880 źi ka 280 nm, ćhiven la duvar anθ-o bufèro e phanglimasko, thaj utilizin i sasti procedura pale anθ-i kolona DEAE On purification. Diluisaren e frakcie save si len A880/A280 raportura maj bare sar 1.7 thaj A880/A805 raportura maj bare sar 3.0, keren o trinto ćàso e ionenqo paruvipen, thaj astaren e frakcie saven si A880/A280 raportură maj bare sar 2.2 thaj A880/A805 raportură maj bare sar 0.05. O parśialno purifikuime komplekso sas koncentrime źi ka ~2 ml anθ-o jekh Amicon 100,000 molecular weight cut-off (MWCO) centrifugal filtro (Merck, UK), thaj thodino anθ-i jekh Superdex 200 16/600 bari ekskluziaqi kolona (GE Healthcare, US) savi sas la 200 mM NaCl, thaj palal kodoja sas thodino anθ-o sa kodo bufèro anθ-o sa kodo bufèro 15.000. CV. Kolektirinen e absorpciake spektrura e bare ekskluzivno frakciake, thaj koncentririnen e absorpciake spektrura e A880/A280 raporturenca upral 2.4 thaj A880/A805 raportura upral 5.8 dži ko 100 A880, thaj sigo utilizin len vash e cryo-TEM grid preparacia vaj garavipe Te arakhen pe -80°C zhi kana trubul.
I solubilizàciaqi membrana katar o PufW-His sas thodini anθ-i jekh 20 ml HisPrep FF Ni-NTA Sepharose kolona (20 mM tris-HCl (pH 8.0) savi sas la 200 mM NaCl thaj 0.03% (w/w)) anθ-o IMAC bufèro ( GE Healthcare). v) β-DDM]. I kolona sas thovdi pandž CV-enca IMAC buferesqe, thaj palal panз CV-urenca IMAC buferesqe save sas len 10 mM histidina. O kerdo komplekso sas eluime katar e kolona pandž IMAC buferenca save sas len 100 mM histidina. I frakcia savi si la o RC-LH114-W komplekso si koncentrime źi ka ~10 ml anθ-o jekh ćhivdo tanko ekipirime e Amicon 100,000 MWCO filtrosa (Merck, UK), diluime 20 drom e phanglimasko buferosa, thaj palal kodoja thodino anθ-o 25 ml Anθ-i DEAE Sepharose kolona, ​​śtar CV buferură si utilizirime anθ-o bufero b phandlo anglal. Thov e kolona śtar CV phanglimaske buferurenca, palal kodoja eluisaren o komplekso pe oxto CV-ură pe jekh linearno gradiènto 0 źi ka 100 mM NaCl (anθ-o phanglimasko bufèro), thaj e aver śtar CV-ură save si len 100 mM phanglimasko bufèro. A880/A805 raporto maj baro katar 4.6 frakcie sas koncentrime ko ~2 ml ano Amicon 100,000 MWCO centrifugalno filtro, thaj pherdo 1.5 CV IMAC anglal Buffer equilibrid Superdex 200 16/600 baripe ekskluzivno kolona, ​​thaj palo odova eluirime ko sasto bufer upral 1.5 CV. Kolektirinen e absorpciake spektrura e bare-ekskluzivne frakcienqe thaj koncentrisaren e absorpciake spektrura e A880/A280 raporturenca upral 2.1 thaj A880/A805 raporturenca upral 4.6 źi ka 100 A880, save si sigo utilizirime vaś e preparacia e TEM grid-esqi ćhivdi vaj garavde k-o -80°C źi kana trubul.
Jekh Leica EM GP imerzijako frižider sas kerdo te kerel pes TEM gridura e tikne temperaturake. O komplekso sas diluime ano IMAC buferi dži ko A880 kotar 50, thaj palo odova 5μl sine čhivdo ko nevo glow-discharged QUANTIFOIL 1.2/1.3 karbon-coated copper mesh (Agar Scientific, UK). Inkubirinen o mreža ko 20°C thaj 60% relativno humiditeta 30 s, palo odova ćhiven la te sušinen 3 s, thaj palo odova ćhiven la ko likvido etan ko -176°C.
E data katar o RC-LH114-W komplekso sas registrime pe eBIC (Electronic Bioimaging Center) (British Diamond Light Source) e Titan Krios mikroskoposa, savo kerel buti pe jekh akceleraciaki voltaža 300kV, e nominalo barjardipnasa 130,000× thaj e energijasa Choo-se gap e 20V. Jekh Gatan 968 GIF Quantum e K2 peak detektorosa sas kerdo te registril pes e image ando ginavimasko modo te kidel pes data. O kalibrime pixelosko barope si 1.048Å, thaj o dozako procento si 3.83 e-Å-2s-1. Kidisardem o filmo anθ-e 11 sekunde thaj uladem les anθ-e 40 kotora. Utilizin o than pherdo karbono te refokusirinen o mikroskopo, thaj palal kodoja kiden trin filmora anθ-jekh ćoro. Sa khetane, 3130 filmora sas kidine, e defokusoske valutenqe maśkar -1 thaj -3μm.
E data vash o RC-LH116 komplekso sas kidine kotar o sasto mikroskopo ko Asterbury Biostructure Laboratory (University of Leeds, UK). E data sas kidine ano modo e ginavipnasko e barjaripnasa 130 k, thaj o barope e pikselosko sas kalibririmo ko 1.065 Å e dozasa 4.6 e-Å-2s-1. O filmo sas kerdo ano 12 sekunde thaj ulado ano 48 kotora. Sa khetane, 3359 filmora sas kidine, e defokusoske valutenqe maśkar -1 thaj -3μm.
Sa o procesiripe e datengo si kerdo ano Relion 3.0 pipeline (42). Keren buti e Motioncorr 2 (43) te laćharen o phiripen e śukaripnasko e dozaqo, thaj palal kodoja keren buti e CTFFIND 4.1 (44) te dikhen o paramètro CTF (funkcia e transferosqi e kontrastosqi). Tipicno fotomikrografura palal kadala anglune procesura si sikavde ande Figura 2. S16. O automatikano alosarimasko šablono si kerdo kana manualno alosarel pes karing 250 pikselura katar 1000 partikle ande jekh 250-pikselosko fremo thaj bi referencako duj-dimenzionalo (2D) klasifikacia, kadea ke nakhen pes kodola klasifikacie save arakhen e kontaminacia e probako vaj naj len diskriminirime karakteristike. Palal, sas kerdini automatikani selekcia pe sa e mikrofotografie, thaj o RC-LH114-W sas 849,359 partikle, thaj o RC-LH116 komplekso sas 476,547 partikle. Sa le alosarde partikle nakhle duj runde bi-referencijake 2D klasifikaciake, thaj palal sako phiripe, le partikle save arakhen o karbonosko than, kontaminacia e probako, bi obviousno karakteristikengo vaj zurales preklopime partikle si refuzime, so kerel 772,033 (90.9%) thaj 359.678 (75.58) partikle save si hasnime vash 3D klasifikacia. RC-LH114-W thaj RC-LH116 respektivno. O angluno 3D referencaqo modelo sas kerdo anθ-i metoda e stokastikane gradientosqi. Sar referènca, o angluno modelo, e alosarde partikle si klasifikuime anθ-e śtar kategorie anθ-o 3D. Sar referènca, ker o modelo anθ-i kadaja kategoria, ker 3D rafinàcia p-e partikule anθ-i maj bari kategoria, palal kodoja labărel o angluno 15Å low-pass filtro te phandel pes i rig e solventosqi, thov 6 piksèlură śukar kantură, thaj post-procesisar le piksèlură te laćhares i Gatan K2 peak Modulation transfer funkcia e oprune detektoresqi. Palal o RC-LH114-W dataset, kadava angluno modelo sas modifikuime katar o ćhivipen e zurale densitetosqo anθ-e riga e maskaqe (diskonektime katar o densiteto e kompleksosqo anθ-o UCSF Chimera). E modelura save avile (e rezolucie RC-LH114-W thaj RC-LH116 si 3.91 thaj 4.16 Å, respektivno) si hasnime sar referenca vash o dujto roundo 3D klasifikaciako. E partikle save si hasnime si grupirime ande angluni 3D klasa thaj naj len zurali korelacia e paśutnesa. Overlap vaj o bi-aśtipen te dikhen pes e strukturàlo xarakteristike. Palal o dujto ćhon e 3D klasifikaciaqo, sas alosardi i kategoria savi si la maj bari rezolucia [Vaś o RC-LH114-W, jekh kategoria si 377,703 partikle (44,5%), vaś o RC-LH116, si duj kategorie, totalo 260,752 partikle (54,77% W), numaj kana von si sa kodola palal kodola, kana si len sa kodola. angluni rotacia e tikne diferèncaça]. E alosarde partikle si pale avri line ande jekh 400-pixeloski kutia thaj rafinime katar 3D rafinipe. I maska ​​e solventosqi si kerdini anθ-o angluno 15Å tikno-paśutno filtro, 3 pikselosqi mapaqi expanzia thaj 3 pikselenqi kovli maska. Ko utiliziribe e per-partikulake CTF rafinàciaqi, per-partikulaqi mociaqi korekcia thaj o dujto ćàso e per-partikulaqe CTF rafinàciaqo, 3D rafinàcia, solventosqo maskaripe thaj post-procesing si kerde palal svako paso te maj dur rafinisarel pes i rezultàto tekstura. Sar hasnisaras o FSC (Fourier Shell Correlation Coefficient) cut-off value 0.143, e rezolucie e agorutne modelurenqe RC-LH114-W thaj RC-LH116 si 2.65 thaj 2.80Å, respektiv. I FSC kurva e agorutne modelosqi si sikavdi anθ-i Figura 2. S17.
Sa e proteinenge sekvence si tele line katar o UniProtKB: LH1-β (PufB; UniProt ID: Q6N9L5); LH1-α (PufA; UniProtID: Q6N9L4); RC-L (PufL; UniProt ID: O83005); RC-M (PufM; UniProt ID: A0A4Z7); RC-H (PuhA; UniProt ID: A0A4Z9); Protein-W (PufW; UniProt ID: Q6N1K3). SWISS-MODEL (45) sas kerdo te kerel pes jekh homologiaqo modelo e RC-esqo, savo si les e proteinenqe sekvence e RC-L, RC-M thaj RC-H thaj i kristaloski struktura e Rba-qi. sphaeroides RC sas kerdo sar šablono (PDB ID: 5LSE) (46). Koristinen o “fit map” instrumento ki UCSF Chimera te śaj te ćhiven o kerdo modelo ki mapa (47), te laćharen i proteinaki struktura, thaj te keren kofaktori [4×BChl a (monomere bibliotekaqo rezidùo anav = BCL), 2×BPh a (BPH), jekh vaj duj vrjama UQ10 (U10), jekh na-heme fero (Fe) thaj jekh 34 hexadicholino (QAK)] utilizin o Coot (48) te thoven. Sar o QAK na si disponiblo ki monomeroski biblioteka, vov sas parametrizirimo kotar o eLBOW instrumento ki PHENIX (49).
Maj dur, o LH1 subunit sas kerdo. Anglal, o automatikano konstrukciako instrumento ando PHENIX (49) sas kerdo te kerel automatikane kotor katar e LH1 sekvenca utilizindos e mapa thaj e LH1-α thaj LH1-β protein sekvence sar input. Alosar o maj kompleto LH1 subunit, ćhiv les avri thaj thov les anθ-o Coot, manualo thov i xasardi sekvenca anθar late, thaj manualo thov i sasti struktura anglal te thoves duj BCls a (BCL) thaj jekh spiriloxanthin (CRT) [palal o relevanto Rps I densitàta e LH1 kompleksosqi thaj o prinʒardo karotenoidno sasto. Specija (17)]. Kopirin o pherdo LH1 subunit, thaj utilizin o UCSF Chimera “Docking Map Tool” te astaren ande paśutni na-modeloski rig e LH1 densitàta, thaj palal kodoja te rafinisaren la anθ-o Coot; repetisar o proceso źi kana sa e LH1 subunitètură si modelisarde. Palal i RC-LH114-W struktura, kana lel pes i na-alokuime densitàta anθ-o Coot, o proteino si segmentisardo katar e aver na-proteinqe komponente anθ-i USCF Chimera mapa thaj o Autobuild-esqo instrumento si utilizisardo te kerel pes o angluno modelo, thaj e aver subunitètură (protein-W) Modeling. Ano PHENIX (49). Thov sa e sekvence save xasajle ko modelo savo resljarda ko Coot (48), thaj palo odova manualno rafinisaren i sasti subuniteta. O aver na-alokuime densitàta śaj te avel laćhi e kombinàciaça e lipidenqi (PDB monomer bibliotèka ID e CDL = CDL, POPC = 6PL thaj POPG = PGT), β-DDM detergento (LMT) thaj UQ10 molekule (U10). Keren buti e PHENIX optimizàciaça (49) thaj e manualo optimizàciaça anθ-o Coot (48) te perfektisaren o pherdo angluno modelo źi kana e modelosqi statistika thaj o vizualo kvaliteto e fitosqo naśti te aven maj laćharde. Po agor, utilizin o LocScale (50) te śukarǎren i lokalo mapa, thaj palal kodoja keren but aver ćàsurǎ te modelisaren i na-alokuime densitàta thaj i automàtikani thaj manuàlo optimizàcia.
E respektivne peptidura, kofaktora thaj aver lipidura thaj kinonura phangle ande lenge respektivne densitetura si sikavde ande Figura 1 thaj 2. S18 dži ko S23. I statistikani informàcia pal-o agorutno modelo si sikavdi anθ-i Tèbla S1.
Te na si aver specifiko, e UV/Vis/NIR absorpciake spektrura sas kidine pe jekh Cary60 spektrofotometro (Agilent, USA) pe 1 nm intervalura katar 250 nm dži ko 1000 nm thaj jekh integraciako vaxt 0.1s.
Diluisaren o egzàmplo anθ-i jekh kvarcoski kuveta 2 mm drom karing o A880 kaθar 1, thaj kiden o spektro e absorpciaqo maśkar 400 thaj 1000 nm. E cirkularno dikroikane spektrura sas kidine pe jekh Jasco 810 spektropolarimetro (Jasco, Japan) pe 1 nm intervalura maškar 400 nm thaj 950 nm pe jekh skanipeski frekvenca 20 nm min-1.
O molarno extinkciaqo koefìciento si determinisardo kana o ćororo komplekso si diluime źi k-o A880 karing 50. Diluisaren o 10μl volumo anθ-o 990μl phanglimasko bufèro vaj metanol, thaj kiden o spektro e absorpciaqo sigo te śaj te tiknjaren i BChl degradàcia. O BChl sasto kotar sakova metanolsko mostro sas kerdo kotar o extinkciako koeficiento ko 771 nm kotar 54.8 mM-1 cm-1, thaj o extinkciako koeficiento sas determinirimo (51). Dikh e mesurime BChl koncentràcia 32 (RC-LH114-W) vaj 36 (RC-LH116) te arakhel pes i koncentràcia e śerutne kompleksosqi, savi si palal kodoja utilizirime te dikhel pes o spektro e absorpciaqo e saste mostresqo kidino anθ-o koefìciento Extinkciaqo bufèro. paralèlo. Trin repetitivne mesura sas kerde vash sakova misal, thaj o mashkaruno absorbanso e BChl Qy maksimumosko sas kerdo vash o ginavipe. O extinkciaqo koefìciento e RC-LH114-W-esqo mesurime ko 878 nm si 3280±140 mM-1 cm-1, kana o extinkciaqo koefìciento e RC-LH116 mesurime ko 880 nm si 3800±30 mM-1 cm-1.
UQ10 sas kvantifikuime palal i metoda anθ-o (52). Ko skurto, o HPLC e fazako pherdo (RP-HPLC) sas kerdo kotar o Agilent 1200 HPLC sistemo. Te ćhivel pes karing 0.02 nmol RC-LH116 vaj RC-LH114-W anθ-e 50μl 50:50 metanol:kloroformo savo si les 0.02% (w/v) ferriko klorido, thaj te injektisares o anglal-ekilibrime Beckman Coulter Ultrasphere ODS 4 mml te ćhivel pes anθ-o 1-1-1-ml. 40°C ano HPLC solvento (80:20 metanol:2-propanol) pe jekh ×25 cm kolona. Keren izokratikani elucia anθ-o jekh HPLC solvènto te dikhen i absorbàcia anθ-o 275 nm (UQ10), 450 nm (carotenoids) thaj 780 nm (BChl) vaś 1 òra. O maj baro nivelo ano 275 nm kromatogramo ko 25.5 minutia sine integririmo, savo na sine les nisave aver detektibilno komponente. I integrime rig si kerdini te ginavel pes o molarno kotor e UQ10-esko avri lino ande relacia e kalibraciake kurvasa kerdini katar e injekcia e purane standardurenqi katar 0 źi ka 5.8 nmol (Figura S14). Sako egzàmplo sas analizime anθ-e trin replikàcie, thaj o raportisardo xatăripen korespondisarel e SD-esqe e prodùsoça.
Jekh solucia savi si la o RC-LH1 komplekso e maj bari Qy absorpciasa 0.1 sas kerdini 30 μM redukime horse heart citochrome c2 (Merck, UK) thaj 0 dži ko 50 μMUQ2 (Merck, UK). Trin 1-ml mostre sas kerdine pe sako UQ2 koncentracia thaj inkubirime sa e ratyi ando tunyariko pe 4°C te siguril pes kompletno adaptàcia ko tunyariko anglal o meripe. I solucia sas thovdi anθ-o OLIS RSM1000 modulàro spektrofotomètro ekipirisardo 300 nm jag/500 liniaqo rèśa, 1.24 mm andre, 0.12 mm maśkar thaj 0.6 mm avri ćàsura. Jekh 600 nm lungo paso filtro si thodino ko vudar e fototubesko e mostresko thaj e referencake fotomultiplikatoresko tubusko te na avel ekscitàciaqo svetlo. I absorbàcia sas monitorisardi ko 550 nm e integràciaqe vràmaça 0.15 s. I lumia e excitàciaqi si ćhudini katar o 880 nm M880F2 LED (Light Emitting Diode) (Thorlabs Ltd., UK) prekal jekh optikano kablo 90% intenziteto prekal jekh DC2200 kontrolèro (Thorlabs Ltd., UK) thaj si ćhudini katar o śukaripen anθ-o jekh angluno 90°. O meripe si kontra o spegulo te del palpale savi godi lumia savi na sas anglunes absorbime katar o misal. Dikhen i absorbàcia 10 s anglal o śukaripen 50 s. Palal kodoja i absorbància sas maj dur monitorisardi 60 s anθ-o tuniariko te dikhel pes o śero źi kaj o quinolol spontano redukisarel o citokromo c23 + (dikh i Figura S8 vaś e śukar dàte).
E data sas procesirime kana sas thodino jekh linearno angluno drom andar 0.5 źi ka 10 s (dependindoj katar i UQ2 koncentràcia) thaj kana sas kerdo o prodùso e śtatosqo sa e trin mostrenqo anθ-e svako UQ2 koncentràcia. I RC-LH1 koncentràcia kerdini katar o respektivo extinkciaqo koefìciento sas utilizirime te paruvel pes i rèta anθ-i katalitikani efikasità, xramosardi anθ-o Origin Pro 2019 (OriginLab, USA), thaj thovdi anθ-o Michaelis-Menten modelo te dikhel pes e dikhline Km thaj Kcat valutură.
Palal e tranzitorikane absorpciake meśimata, o RC-LH1 egzàmplo sas diluime źi ka ~2μM anθ-o IMAC bufèro savo sas les 50 mM natrium askorbàto (Merck, USA) thaj 0.4 mM Terbutin (Merck, USA). O askorbiko acido si kerdo sar sakrifisosko elektronosko donori, thaj o tert-butaclofen si kerdo sar QB inhibitoro te siguril pes kaj o maj baro RC donori ačhol redukime (vaś te phenas, na fotooksidirime) anθ-o sasto proceso e meśipnasqo. Aproksimativno 3 ml e mostrengo si thodine ki jekh personalizirime rotaciaki ćhelja (paśe 0.1 m ano diametro, 350 RPM) e 2 mm optikane droma lungipesa te sigurinel pes kaj o proba ko lasersko drom isi la dosta vrama vash e kalo adaptàcia maśkar e excitaciaqe pulsura. Keren ~100-fs laser pulsura te amplifikuin o Ti: Sapphire laser sistemo (Spectra Physics, USA) te excitirinen o misal ko 880 nm ko repeticiako 1 kHz (20 nJ vash NIR ja 100 nJ vash Vis). Anglal te kiden pes e dàte, thoven o egzàmplo anθ-i lumà e excitaciaqi karing 30 minutură. I ekspozicia ka kerel QA inaktivàcia (śaj te redukisarel o QA jekh vaj dujvar). Numaj mangav tumen te dikhen kaj akava proceso si reverzibilno soske palo lungo periodo e ćorre adaptàciaqo, o RC ka iril pes tikno-tikno k-i QA aktivitèta. Jekh Helios spektrometro (Ultrafast Systems, USA) sas kerdo te mezij e tranzitno spektrura e vramasa -10 dži ko 7000 ps. Keren buti e Surface Xplorer softveresa (Ultrafast Systems, USA) te ćhiven e grupe e datengo, palal kodoja te keren jekhipe thaj te standardizirinen len. Keren buti e CarpetView softveresqe (Light Conversion Ltd., Lithuania) te utilizin o kombinime dataset te len diferentno spektrura save si phangle e degradàciaça, vaj utilizin jekh funkcia savi konvolviril but eksponènturǎ e instrumentosqe respònsosa te śaj te avel la jekh spektràlo evolucia anθ-o Origin (OriginLab, USA).
Sar so si phendo maj opre (53), sas kerdo jekh fotosintetikano filmo savo si les LH1 komplekso bi RC thaj periferikano LH2 antena. I membrana sas diluime anθ-e 20 mM tris (pH 8.0) thaj palal kodoja sas thovdi anθ-i jekh kvarcoski kuveta la jekh 2 mm optikano drom. Jekh 30nJ lasersko pulso sas kerdo te excitiril o egzàmplo ko 540 nm e vràmaça -10 źi ka 7000 ps. Procesirinen o set e datengo sar si deskriptirime vash Rps. pal misal.
I membrana sas peletirime centrifugaciasa ko 150,000 RCF 2 chasura ko 4°C, thaj palo odova lako absorbipe ko 880 nm sas resuspendime ko 20 mM tris-HCl (pH 8.0) thaj 200 mM NaCl. Xasaren i membrana tikno tikno ćhivindoj 2% (w/v) β-DDM 1 ćàso anθ-o tuniariko 4°C. O egzàmplo sas diluime anθ-o 100 mM triethylammonium carbonate (pH 8.0) (TEAB; Merck, UK) źi k-i jekh proteinaqi koncentràcia 2.5 mg ml-1 (Bio-Rad analìza). Maj dur procesiripe sas kerdo katar i maj anglal publikime metoda (54), astarindoj e diluciasa 50 μg proteina ande jekh totalo 50 μl TEAB ande savo sas 1% (w/v) natrium laurato (Merck, UK). Palal i sonikacia 60 s, sas redukime 5 mM tris(2-carboxyethyl)phosfin (Merck, UK) k-i 37°C 30 minutură. Palal i S-alkilacia, inkubisarel pes i proba 10 mM methyl S-methylthiometansulfonate (Merck, UK) thaj thovel pes anθar jekh 200 mM izopropanol stock solucia vaś 10 minutură anθ-i temperatura e sobake. I proteolitikani digestia sas kerdini kana thode 2 μg trypsin/endoproteinase Lys-C mikstura (Promega UK) thaj inkubirime ko 37°C 3 chasura. O laurato surfaktanto sas avri lino kana sas thodino 50 μl ethyl acetate thaj 10 μl 10% (v/v) LC grade trifluoroacetic acid (TFA; Thermo Fisher Scientific, UK) thaj vortexing 60 s. I fazaki separacia sas promovirimi katar e centrifugacia ko 15,700 RCF 5 minutia. Palal o protokolo e fabrikantosqo, jekh C18 spin kolona (Thermo Fisher Scientific, UK) sas utilizirime te aspirisarel pes thaj te ćhivel pes o śukar e maj tele faza savi sas la o peptido. Palal o sušipe e vakuumoske centrifugaciasa, o egzàmplo sas xasardo anθ-o 0,5% TFA thaj 3% acetonitrilo, thaj 500 ng sas analizime anθ-i nanoflow RP kromatografia phangli e masesqe spektrometriaça labǎrindoj e sistemosqe paramètrură detalìzuime maj anglal.
Ker buti e MaxQuant v.1.5.3.30 (56) vaś i identifikàcia thaj i kvantifikàcia e proteinenqi te rodes Rps. palustris proteome databaza (www.uniprot.org/proteomes/UP000001426). E data e proteomikane spektrometriake e maseske sas depozitime ki ProteomeXchange Alliance prekal o PRIDE partneresko depozito (http://proteomecentral.proteomexchange.org) telal o identifikatori e datasetosko PXD020402.
Palal i analìza katar o RPLC phanglo e elektrospray ionizaciaqe spektrometriaça, o RC-LH1 komplekso sas kerdo katar o Rps katar o ćororo. Ko utiliziribe e maj anglal publikime metoda (16), i proteinaki koncentràcia kerdini anθ-e palustrisqe ćhelǎ sas 2 mg ml-1 anθ-e 20 mM Hepes (pH 7.8), 100 mM NaCl thaj 0.03% (w/v) β- (Bio-Rad analìza) ) DDM. Palal o protokolo e fabrikantosqo, labăren o 2D purifikaciaqo kit (GE Healthcare, USA) te xramosaren 10 μg proteina anθ-i metoda e precipitaciaqi, thaj te ćhiven o precipitato anθ-o 20 μl 60% (v / v) formic acid (FA), 20% (v / v) Acetonitrile thaj 20% (v/v) pani. Pandž mikrolitre sas analizime katar RPLC (Dionex RSLC) phanglo e spektrometrijasa e masaki (Maxis UHR-TOF, Bruker). Keren buti e MabPac 1.2×100 mm kolona (Thermo Fisher Scientific, UK) vaś o ulavipen ko 60°C thaj 100μlmin -1, e gradientosa 85% (v / v) solvent A [0.1% (v / v) FA thaj 0.02% (V/v) TFA pani solucia] ko solvento(v / v) [0.1%(v/v) FA thaj 0.02%(v/v) anθ-o 90%(v/v) acetonitrile TFA] Uźindoj standardo elektrospray ionizaciaqo źanglipe thaj paramètrură default vaś maj but de 60 minutură, o mass spektrometro lel 100 źi k-o 2750 m/z (mass-ratio-charge ratio). E źutipnaça katar o ExPASy bioinformatikaqo resurso portalo FindPept tool (https://web.expasy.org/findpept/), mapin o spektro e masesqo karing e subunitètură le kompleksosqe.
E ćhelura sas barjarde 72 òre telal 100 ml NF-tikno (10μMm-2 s-1), maśkar (30μMm-2 s-1) vaj baro (300μMm-2 s-1) śukaripen. M22 mediumo (M22 mediumo ande savo o amoniumo sulfato si ćhudino thaj o natriumo succinato si paruvdo katar o natriumo acetato) ande jekh 100 ml śuruvno buti (23). Ano pandž 30-s ciklura, 0.1 mikron stakloske perle sas perle ano volumesko raporto 1:1 te lizirinen e selie thaj te oven ćhivde pe glazura 5 minutia. E na-solubilno materija, e na-phagerde ćhelura thaj e stakloske perle sas line avri katar e centrifugacia pe 16,000 RCF 10 minutura ande jekh mikrocentrifuga pe skafidi. I membrana sas ulavdi anθ-o jekh Ti 70.1 rotoro 100,000 RCF anθ-o 20 mM tris-HCl (pH 8.0) anθ-o jekh 40/15% (w/w) sukrozaqo gradiènto vaś 10 òre.
Sar so si deskriptirime ande amari angluni buti, imunodetekcia e His tag-esko pe PufW (16). Ko skurto, o purifikuime kerdo komplekso (11.8 nM) vaj i membrana savi si la sa kodola koncentracie RC (determinisardi katar o oxidacia so lel o redukime diferencijako spektro thaj malavel o pharipe pe o pherdo gelo) ande 2x SDS pherdo buferi (Merck, UK) diluime duvar. E proteine ​​sas ulade pe jekh replika 12% bis-tris NuPage gel (Thermo Fisher Scientific, UK). Jekh gelo sas farbime e Coomassie Brilliant Blue (Bio-Rad, UK) te shaj te pherdol thaj te vizualizirinel e RC-L subunit. O proteino pe dujto gelo sas transferime ki metanol-aktivirime poliviniliden fluoride (PVDF) membrana (Thermo Fisher Scientific, UK) vash imunoanaliza. I PVDF membrana sas blokirime anθ-o 50 mM tris-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl, 0.2% (v / v) Tween-20 thaj 5% (w / v) ćorri thud, thaj palal kodoja sas inkubirime anθ-o anti-His primarno antikorpo (anθ-o Dilute o antikorpo [50 mM tris-HCl) 7.6), 150 mM NaCl thaj 0.05% (v/v) Tween-20] anθ-o 1:1000 A190-114A, Bethyl Laboratories, USA) vaś 4 òre. Palal o thovipen 3 drom 5 minutură anθ-o antikorposqo bufèro, i membrana sas kombinisardi e horseradish peroxidase-eça (Sigma-Aldrich, UK) anti-muśesqo sekundarno antikorpo (diluime 1:10,000 anθ-o antikorposqo bufèro) Inkubàcia te śaj te arakhel pes (5 minutură palal 3 thovipen anθ-o antikorposqo bufèro) labǎrindoj WAR 2000. substrato e chemiluminescencako (Cyanagen, Italia) thaj Amersham Imager 600 (GE Healthcare, UK).
Te drabarel pes i distribùcia e intenzitetosqi vaś svako rangărdo gel vaj imunoanalizaqo drom, integrisarindoj i rig telal o śero thaj ginavindoj o raporto e intenzitetosqo maśkar RC-L (farbime gel) thaj Protein-W (imunoanaliza), anθ-o ImageJ (57) Procesisaren i imàgi. Kadala raportura sas konvertirime ko molarno raportura kana sas kerdo o gindipe kaj o raporto RC-L thaj proteino-W ano purano RC-LH114-W misal sas 1:1 thaj normalizirindoj o sasto set e datengo sar trubul.
Palal maj but materiàlură vaś kadava lil, mangas tumen te dikhen http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1
Akava si putardo akceso artiklo distribuirimo telal e kondicie e Creative Commons Attribution License. O artiklo del śajsaripen te avel bi-restrikciaqo labăripen, distribùcia thaj reprodukcia anθ-e savi godi rig anθ-i kondicia kaj i originalo buti si laćhes citime.
Nota: Amen mangas tumendar numaj te den tumari e-mail adresa, kadja kaj o manuš savo rekomendisaren les ki rig te džanel kaj kamen te dikhen o e-mail thaj kaj na si spam. Amen na ka astaras nisave e-mail adrese.
Akava pućhipen si kerdo te testisarel pes te san vizitanto thaj te arakhel pes o automatikano bićhaldipen e spam-esqo.
David JK Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P Canniffe , Mark J. Dickman, Dewey Holten, Christine Kirma, Ccoil Necoil Necoilter.
I struktura e bare rezoluciaki e kompleksoski e lumiaki trapa 1 ano reakciako centro del neve dikhimata ki dinamika e kinoneski.
David JK Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P Canniffe , Mark J. Dickman, Dewey Holten, Christine Kirma, Ccoil Necoil Necoilter.
I struktura e bare rezoluciaki e kompleksoski e lumiaki trapa 1 ano reakciako centro del neve dikhimata ki dinamika e kinoneski.
©2021 Amerikani Asociàcia vaś o Anglunipe e Scienciaqo. sa le hakaja si garavde. AAAS si partneri e HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef thaj COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.